豬流行性腹瀉病毒的感染和分子特征及下一代測序技術(shù)在挖掘新病原的應(yīng)用研究.pdf

1、豬腸道冠狀病毒病主要病原是豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬重組腸道冠狀病毒(SeCoV)以及新近報(bào)道的豬腸道阿爾法冠狀病毒(PEACoV)。這些病原感染導(dǎo)致豬不同程度的腸道問題，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，世界范圍內(nèi)豬腸道冠狀病毒病呈現(xiàn)出新發(fā)和再發(fā)特點(diǎn)。傳統(tǒng)意義上，TGEV和豬A群輪狀病毒(RV)可引起不同日齡仔豬發(fā)生腹瀉。但自2010年底以來，免疫豬群中出現(xiàn)了

2、變異PEDV導(dǎo)致包含中國和美國在內(nèi)的全球主要養(yǎng)豬國家發(fā)生PED，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本文圍繞豬流行性腹瀉病毒的感染和分子特征及下一代測序技術(shù)在新病原挖掘方面的應(yīng)用進(jìn)行了如下研究:
　　1.我國PED流行情況及PEDV的分子特征
　　2010年底以來，以免疫豬群發(fā)病、傳播速度快、季節(jié)性不明顯、發(fā)病率和死亡率高為臨床特征的腹瀉病在我國主要養(yǎng)豬區(qū)蔓延。為了研究我國三種常見病原的感染特點(diǎn)，本研究使用三重RT-PCR方法(PEDV、TG

3、EV和PoRV)檢測了我國2012年至2015年的采集的2643份臨床樣品。結(jié)果表明，這一期間PEDV、TGEV和PoRV的檢出率分別是61.1％(1615/2643)、0.6％(12/2076)和5.2％(95/1828)。在此基礎(chǔ)上，為了增加對中美兩國新型PEDV毒株基因特征的了解，本文測定了不同PEDV毒株的全S基因和全基因組序列，并進(jìn)行了比對分析，闡明了新毒株與傳統(tǒng)疫苗毒株之間的基因差異。為了進(jìn)一步研究我國不同PEDV毒株的多樣

4、性，本研究對其中的91份典型樣品的S1(1-1323bp)以及其中的46個(gè)樣品的ORF3基因進(jìn)行了測序，結(jié)果顯示變異PEDV毒株基因型在我國占主導(dǎo)地位。發(fā)現(xiàn)了區(qū)分不同PEDV毒株的分子標(biāo)記，為建立鑒別診斷方法奠定基礎(chǔ)。同時(shí)與國內(nèi)同期報(bào)道的314個(gè)PEDV毒株基因序列進(jìn)行比較分析，旨在揭示我國豬流行性腹瀉的病原學(xué)特點(diǎn)。
　　2.美國PED流行情況及PEDV的分子特征
　　通過分析了UMVDL提供的2016年12月-2017年5

5、月來源于美國24個(gè)州的13，269份樣品的三重（PEDV、PDCoV和TGEV）定量RT-PCR的檢測數(shù)據(jù)。檢測結(jié)果表明PEDV、PDCoV和TGEV的檢出率分別是5.8％(763/13，269)、1.0％(137/13，269)和低于0.01％(2/13，269)，結(jié)果表明，PEDV是最常見的豬腹瀉性病原。序列測定發(fā)現(xiàn)，在美國流行的PEDV毒株主要分為新發(fā)的強(qiáng)毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株。為了給臨床檢測提供快速簡便方法

6、，依據(jù)這兩種PEDV S基因序列差異，設(shè)計(jì)引物，通過條件優(yōu)化，建立了具有良好特異性和敏感性的二重RT-PCR鑒別診斷方法。應(yīng)用該方法檢測287份PEDV陽性樣品，結(jié)果表明強(qiáng)毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株單獨(dú)感染的比率分別為80.8％(232/287)和14.6％(42/287)，這兩種毒株的混合感染率是1.0％(3/287)。結(jié)果表明該方法與之前報(bào)道的定量RT-PCR方法的的符合率為:INDELsPEDV毒株91.3％(4

7、2/46)、強(qiáng)毒力PEDV毒株96.6％(229/237)和INDELs PEDV毒株和毒力PEDV毒株75％(3/4)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明兩種檢測方法差異不顯著。
　　3.新型PEDV毒株分離鑒定和傳代致弱研究
　　從臨床上發(fā)生典型腹瀉豬場（該豬場存在嚴(yán)重的腹瀉問題，一周齡仔株的死亡率可以高達(dá)80％）的仔豬病料中，分離到一株具有代表性的新型PEDV毒株，S基因和全基因組測序，與PEDV流行毒株的同源性較高，確定是變異毒株，命名

8、為PEDVYN1株。為了解新型PEDV毒株的特點(diǎn)以及為減毒疫苗研制奠定基礎(chǔ)。將YN1株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代200代次，采集不同代次病毒進(jìn)行全基因組測序，明確了不同代次病毒的基因變化特點(diǎn)，分析基因變化與細(xì)胞適應(yīng)性、毒力之間的關(guān)系。
　　通過比較新型PEDV毒株YN1與其不同代次衍生毒株的全基因組序列發(fā)現(xiàn)，伴隨著傳代過程，PEDV全基因組序列變化加劇，NSP2、NSP4-7、NSP10、NSP12和NSP13和新型PEDV毒株的細(xì)

9、胞適應(yīng)性沒有直接的關(guān)系。不同PEDV毒株的毒力減弱的分子特點(diǎn)是ORF1a/b和S蛋白存在9-26aa的改變，S蛋白存在1-3個(gè)aa的缺失，ORF3的提前終止和8aa的改變，E、M和N蛋白存在1-3aa的改變。一些核苷酸水平的同義突變，可能也會對新型PEDV毒株的減毒有關(guān)。S蛋白144aa位點(diǎn)的1aa的缺失是新型PEDV毒株減弱的標(biāo)志。結(jié)合動(dòng)物感染試驗(yàn)結(jié)果，表明ORF3基因的提前終止對PEDV毒株的細(xì)胞適應(yīng)性比對其減毒性更為重要。

10、　　將傳代致弱的PEDV YN144株接種仔豬，沒有觀察到腹瀉癥狀，表明YN144為減毒毒株。有限的臨床試驗(yàn)證明，該毒株對仔豬和妊娠母豬安全，并能刺激母豬在乳汁中產(chǎn)生針對PEDV的IgA，具有作為口服疫苗的潛力，為后續(xù)的新型PEDV毒株弱毒疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。
　　4.下一代測序技術(shù)在新病原挖掘方面的應(yīng)用
　　本研究通過下一代測序方法(NGS)在美國發(fā)現(xiàn)了新型TGEV毒株。對明尼蘇達(dá)大學(xué)獸醫(yī)診斷實(shí)驗(yàn)室（UMVDL）提供采集自

11、美國41個(gè)州的2008年1月至2016年11月份的29，397個(gè)臨床病料的TGEV定量檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析，研究了這期間美國TGE的流行情況，結(jié)果表明TGE在美國呈現(xiàn)周期性的發(fā)生，在寒冷的季節(jié)多發(fā)。2013年之后TGEV在美國的檢出小于0.4％。其次通過從頭測序組裝和比對，我們獲得了18株美國TGEV的全基因組序列及一株美國PRCV毒株的全基因組序列，這18株TGEV毒株中，有16株擁有獨(dú)特的8個(gè)基因缺失位點(diǎn)以及199個(gè)氨基酸序列的改變。

12、遺傳進(jìn)化樹分析表明，這16個(gè)毒株形成了新的進(jìn)化分支。這種新型TGEV毒株在美國占主導(dǎo)地位，但其臨床意義還需要進(jìn)一步研究。對新近發(fā)現(xiàn)和鑒定的PRCV的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，該毒株和美國TGEV毒株之間存在重組現(xiàn)象。
　　綜上所述，通過對中美豬腸道冠狀病毒病的流行情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其首要病原是PEDV。對中美PEDV毒株的的分子特征和分子流行病學(xué)的研究闡釋了中美PED復(fù)雜的感染情況。對我國變異PEDV毒株分離和傳代致弱的研究揭示了我國變異