豬流行性腹瀉病毒的感染和分子特征及下一代測序技術在挖掘新病原的應用研究.pdf

1、豬腸道冠狀病毒病主要病原是豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、豬德爾塔冠狀病毒(PDCoV)、豬重組腸道冠狀病毒(SeCoV)以及新近報道的豬腸道阿爾法冠狀病毒(PEACoV)。這些病原感染導致豬不同程度的腸道問題，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。目前，世界范圍內豬腸道冠狀病毒病呈現(xiàn)出新發(fā)和再發(fā)特點。傳統(tǒng)意義上，TGEV和豬A群輪狀病毒(RV)可引起不同日齡仔豬發(fā)生腹瀉。但自2010年底以來，免疫豬群中出現(xiàn)了

2、變異PEDV導致包含中國和美國在內的全球主要養(yǎng)豬國家發(fā)生PED，造成嚴重經(jīng)濟損失。本文圍繞豬流行性腹瀉病毒的感染和分子特征及下一代測序技術在新病原挖掘方面的應用進行了如下研究:
　　1.我國PED流行情況及PEDV的分子特征
　　2010年底以來，以免疫豬群發(fā)病、傳播速度快、季節(jié)性不明顯、發(fā)病率和死亡率高為臨床特征的腹瀉病在我國主要養(yǎng)豬區(qū)蔓延。為了研究我國三種常見病原的感染特點，本研究使用三重RT-PCR方法(PEDV、TG

3、EV和PoRV)檢測了我國2012年至2015年的采集的2643份臨床樣品。結果表明，這一期間PEDV、TGEV和PoRV的檢出率分別是61.1％(1615/2643)、0.6％(12/2076)和5.2％(95/1828)。在此基礎上，為了增加對中美兩國新型PEDV毒株基因特征的了解，本文測定了不同PEDV毒株的全S基因和全基因組序列，并進行了比對分析，闡明了新毒株與傳統(tǒng)疫苗毒株之間的基因差異。為了進一步研究我國不同PEDV毒株的多樣

4、性，本研究對其中的91份典型樣品的S1(1-1323bp)以及其中的46個樣品的ORF3基因進行了測序，結果顯示變異PEDV毒株基因型在我國占主導地位。發(fā)現(xiàn)了區(qū)分不同PEDV毒株的分子標記，為建立鑒別診斷方法奠定基礎。同時與國內同期報道的314個PEDV毒株基因序列進行比較分析，旨在揭示我國豬流行性腹瀉的病原學特點。
　　2.美國PED流行情況及PEDV的分子特征
　　通過分析了UMVDL提供的2016年12月-2017年5

5、月來源于美國24個州的13，269份樣品的三重（PEDV、PDCoV和TGEV）定量RT-PCR的檢測數(shù)據(jù)。檢測結果表明PEDV、PDCoV和TGEV的檢出率分別是5.8％(763/13，269)、1.0％(137/13，269)和低于0.01％(2/13，269)，結果表明，PEDV是最常見的豬腹瀉性病原。序列測定發(fā)現(xiàn)，在美國流行的PEDV毒株主要分為新發(fā)的強毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株。為了給臨床檢測提供快速簡便方法

6、，依據(jù)這兩種PEDV S基因序列差異，設計引物，通過條件優(yōu)化，建立了具有良好特異性和敏感性的二重RT-PCR鑒別診斷方法。應用該方法檢測287份PEDV陽性樣品，結果表明強毒力PEDV毒株和INDELs PEDV毒株單獨感染的比率分別為80.8％(232/287)和14.6％(42/287)，這兩種毒株的混合感染率是1.0％(3/287)。結果表明該方法與之前報道的定量RT-PCR方法的的符合率為:INDELsPEDV毒株91.3％(4

7、2/46)、強毒力PEDV毒株96.6％(229/237)和INDELs PEDV毒株和毒力PEDV毒株75％(3/4)。統(tǒng)計學分析表明兩種檢測方法差異不顯著。
　　3.新型PEDV毒株分離鑒定和傳代致弱研究
　　從臨床上發(fā)生典型腹瀉豬場（該豬場存在嚴重的腹瀉問題，一周齡仔株的死亡率可以高達80％）的仔豬病料中，分離到一株具有代表性的新型PEDV毒株，S基因和全基因組測序，與PEDV流行毒株的同源性較高，確定是變異毒株，命名

8、為PEDVYN1株。為了解新型PEDV毒株的特點以及為減毒疫苗研制奠定基礎。將YN1株在Vero細胞上連續(xù)傳代200代次，采集不同代次病毒進行全基因組測序，明確了不同代次病毒的基因變化特點，分析基因變化與細胞適應性、毒力之間的關系。
　　通過比較新型PEDV毒株YN1與其不同代次衍生毒株的全基因組序列發(fā)現(xiàn)，伴隨著傳代過程，PEDV全基因組序列變化加劇，NSP2、NSP4-7、NSP10、NSP12和NSP13和新型PEDV毒株的細

9、胞適應性沒有直接的關系。不同PEDV毒株的毒力減弱的分子特點是ORF1a/b和S蛋白存在9-26aa的改變，S蛋白存在1-3個aa的缺失，ORF3的提前終止和8aa的改變，E、M和N蛋白存在1-3aa的改變。一些核苷酸水平的同義突變，可能也會對新型PEDV毒株的減毒有關。S蛋白144aa位點的1aa的缺失是新型PEDV毒株減弱的標志。結合動物感染試驗結果，表明ORF3基因的提前終止對PEDV毒株的細胞適應性比對其減毒性更為重要。

10、　　將傳代致弱的PEDV YN144株接種仔豬，沒有觀察到腹瀉癥狀，表明YN144為減毒毒株。有限的臨床試驗證明，該毒株對仔豬和妊娠母豬安全，并能刺激母豬在乳汁中產(chǎn)生針對PEDV的IgA，具有作為口服疫苗的潛力，為后續(xù)的新型PEDV毒株弱毒疫苗的研究奠定基礎。
　　4.下一代測序技術在新病原挖掘方面的應用
　　本研究通過下一代測序方法(NGS)在美國發(fā)現(xiàn)了新型TGEV毒株。對明尼蘇達大學獸醫(yī)診斷實驗室（UMVDL）提供采集自

11、美國41個州的2008年1月至2016年11月份的29，397個臨床病料的TGEV定量檢測數(shù)據(jù)進行了分析，研究了這期間美國TGE的流行情況，結果表明TGE在美國呈現(xiàn)周期性的發(fā)生，在寒冷的季節(jié)多發(fā)。2013年之后TGEV在美國的檢出小于0.4％。其次通過從頭測序組裝和比對，我們獲得了18株美國TGEV的全基因組序列及一株美國PRCV毒株的全基因組序列，這18株TGEV毒株中，有16株擁有獨特的8個基因缺失位點以及199個氨基酸序列的改變。

12、遺傳進化樹分析表明，這16個毒株形成了新的進化分支。這種新型TGEV毒株在美國占主導地位，但其臨床意義還需要進一步研究。對新近發(fā)現(xiàn)和鑒定的PRCV的全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，該毒株和美國TGEV毒株之間存在重組現(xiàn)象。
　　綜上所述，通過對中美豬腸道冠狀病毒病的流行情況調查發(fā)現(xiàn)，其首要病原是PEDV。對中美PEDV毒株的的分子特征和分子流行病學的研究闡釋了中美PED復雜的感染情況。對我國變異PEDV毒株分離和傳代致弱的研究揭示了我國變異