利用B細胞抗體類別轉(zhuǎn)換模型進行A-EJ修復(fù)通路的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、保持基因組的完整性和穩(wěn)定性對于生物體的存活是至關(guān)重要的。DNA雙鏈斷裂(DSB)是所有DNA損傷中最為嚴重的一種,可以通過外界因素(如電離輻射和化學(xué)誘變劑)和內(nèi)源因素(如內(nèi)源性DNA氧化以及DNA復(fù)制壓力)產(chǎn)生。哺乳動物體內(nèi)的DSB修復(fù)方式主要有兩種:依賴于同源序列的同源重組(HR)和不依賴于同源序列的非同源末端連接(NHEJ)。近幾年的研究發(fā)現(xiàn),在經(jīng)典的非同源末端連接(C-NHEJ)缺失的情況下,DSB末端仍然可以被有效地修復(fù),預(yù)示著

2、非經(jīng)典末端連接(A-EJ)修復(fù)通路的存在。A-EJ活性已經(jīng)在多種系統(tǒng)中得到證實,特別是在C-NHEJ核心因子(如DNA連接酶Ⅳ)缺陷的B細胞中,A-EJ介導(dǎo)的垮H基因座位置的抗體類別轉(zhuǎn)換(CSR)效率是野生型細胞的50%。
  大量研究已經(jīng)證實A-EJ的顯著特點是對微同源序列(MH)的偏好性,以及在染色體轉(zhuǎn)位過程中的重要作用。雖然目前已經(jīng)有多個蛋白因子被報道參與A-EJ過程,但是其結(jié)果往往存在爭議,特別是對參與A-EJ修復(fù)的DNA

3、連接酶的研究還很不清楚。
  本研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng),在Lig4缺陷的小鼠B細胞系CH12F3中完全敲除Lig1或者細胞核內(nèi)的Lig3,建立只含有單個DNA連接酶(分別為Lig3和Lig1)的CH12F3細胞系。令人驚訝的是,只含有Lig1或Lig3的CH12F3細胞仍然具有A-EJ活性,可以有效地催化IgH基因座的CSR過程以及同一條染色體上由CRISPR/Cas9產(chǎn)生的DSB之間的染色體缺失;并且其活性與Lig1

4、/Lig3同時存在的細胞沒有明顯差別。然而,在催化染色體轉(zhuǎn)位方面,含有Lig1和Lig3的復(fù)合物顯示出不同的特性。完全敲除細胞核中的Lig3,Lig4-/-細胞的染色體轉(zhuǎn)位明顯減少,而在完全敲除Lig1的細胞中則沒有這種變化。另外,染色體轉(zhuǎn)位連接處微同源序列的分析揭示了不同DNA連接酶催化活性的特異性。這些數(shù)據(jù)表明存在多種含DNA連接酶的復(fù)合物用以催化A-EJ過程。
  另外,本研究在小鼠B細胞中建立了CRISPR/Cas9高通量

5、篩選方法,在野生型和Lig4缺陷的細胞中篩選參與CSR過程中DSB修復(fù)的基因。首先建立了Cas9穩(wěn)定表達的CH12F3細胞系(野生型和Lig4缺陷型),并對sgRNA篩選的整個過程進行了優(yōu)化。利用優(yōu)化的實驗條件,在Cas9穩(wěn)定表達的WT和Lig4-/-CH12F3細胞中進行sgRNA文庫的高通量篩選。對不同細胞群中的sgRNA進行高通量測序,通過MAGeCK分析方法,篩選IgA陽性細胞群中顯著減少和IgA/IgM雙陰性細胞群中顯著增加的

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