內(nèi)毒素耐受幼鼠肝臟Myd88及ToIIop蛋白表達變化的研究.pdf

1、目的:建立內(nèi)毒素耐受幼鼠模型，研究內(nèi)毒素耐受幼鼠肝臟組織TLR4（Toll樣受體4）/Myd88通路上正性因子髓樣分化蛋白88(Myeloid differentiation factor88，Myd88)及負性因子Toll反應(yīng)蛋白（Tollinteracting protein，Tollip）的表達情況。
　　方法:1、實驗分組:將96只ICR幼鼠（日齡40±2天）隨機分為3組，每組32只幼鼠。第一組為實驗組（預(yù)先刺激組），第二

2、組為實驗對照組（非預(yù)先刺激組），第三組為空白對照組。2、建立內(nèi)毒素耐受模型:(1)采用腹腔注入脂多糖的方法，對實驗組幼鼠經(jīng)腹腔注入0.5mg/kg脂多糖，對實驗對照組及空白對照組幼鼠經(jīng)腹腔注入等容量的生理鹽水。(2)24小時后對實驗組及實驗對照組幼鼠經(jīng)腹腔注入5mg/kg脂多糖，對空白對照組幼鼠經(jīng)腹腔注入等容量的生理鹽水。3、指標檢測:(1)分別在第二次注射0h(第二次注射前)，3h，8h，24h每組隨機選取幼鼠8只，采用眼球摘除法取幼

3、鼠外周血，分離血清，采用酶聯(lián)免疫分析法檢測各組各時間點幼鼠血清晚期細胞因子高遷移率組蛋白B-1（High mobility group protein B-1，HMGB-1）的表達情況。(2)取血后在無菌操作下取幼鼠肝臟組織，并放在4％多聚甲醛固定液中保存，石蠟固定切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測各組各時間點幼鼠肝臟Myd88及Tollip蛋白的表達情況，同時觀察病理改變。
　　結(jié)果:1、幼鼠行為變化:小劑量及大劑量脂多糖刺激后幼鼠均

4、出現(xiàn)少吃、少喝、少動、嗜睡及毛發(fā)散亂等表現(xiàn)，大劑量脂多糖刺激后上訴癥狀尤為明顯，生理鹽水刺激后幼鼠無明顯變化。2、幼鼠血清HMGB-1表達情況:(1)對第二次注射0h、3h幼鼠血清HMGB-1表達量進行組間比較，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，P0h=0.686、P3h=0.356)。(2)對第二次注射8h、24h幼鼠血清HMGB-1表達量進行組間比較，實驗組幼鼠血清HMGB-1表達量明顯低于實驗對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜

5、0.05)，提示內(nèi)毒素耐受模型建立成功;實驗組及實驗對照組幼鼠血清HMGB-1表達量均明顯高于空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)在實驗組及實驗對照組中幼鼠血清HMGB-1出現(xiàn)表達的時間在第二次注射3h-8h時刻之間，在24h時刻時表達并未恢復(fù)至原有基礎(chǔ)水平。3、實驗組幼鼠肝臟組織病理損傷明顯輕于實驗對照組，進一步提示內(nèi)毒素耐受模型建立成功。4、幼鼠肝臟組織Myd88表達情況:(1)對第二次注射前0h幼鼠肝臟組織My

6、d88表達量進行組間比較，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，P0h=0.956)。(2)對第二次注射3h、8h幼鼠肝臟組織Myd88表達量進行組間比較，實驗對照組幼鼠肝臟組織Myd88表達量高于實驗組及空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗組幼鼠肝臟組織Myd88表達量高于空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)對第二次注射24h幼鼠肝臟組織Myd88表達量進行組間比較，實驗對照組幼鼠肝臟組織Myd8

7、8表達量高于實驗組及空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗組幼鼠肝臟組織Myd88表達量與空白對照組比較，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，P24h=0.08)。(4)在實驗對照組中幼鼠肝臟組織Myd88的表達在第二次注射3h時刻已經(jīng)出現(xiàn)，8h時刻最高，24h時刻仍然存在。5、幼鼠肝臟組織Tollip表達情況:(1)對第二次注射0h幼鼠肝臟組織Tollip表達量進行組間比較，各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，P0h

8、=0.98)。(2)對第二次注射3h、8h幼鼠肝臟組織Tollip表達量進行組間比較，實驗組幼鼠肝臟組織Tollip表達量高于實驗對照組及空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);實驗對照組幼鼠肝臟組織Tonip表達量高于空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(3)對第二次注射24h幼鼠肝臟組織Tollip表達量進行組間比較，實驗組幼鼠肝臟組織Tollip表達量略低于實驗對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);

9、實驗組及實驗對照組幼鼠肝臟組織Tollip表達量均明顯高于空白對照組，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)在實驗組及實驗對照組中幼鼠肝臟組織Tollip的表達在第二次注射3h時刻已經(jīng)出現(xiàn)，8h時刻最高，24h時刻仍然存在。6、在第二次脂多糖注射后的8h、24h時刻，Myd88與HMGB-1的表達水平呈正相關(guān)(r8h=0.912，P8h＜0.05; r24h=0.907，P24h＜0.05); Tollip與HMGB-1的表達水平

10、呈負相關(guān)（r8h=-0.950，P8h＜0.05;r24h=-0.829，P24h＜0.05）。7、在第二次脂多糖注射后的3h、8h、24h時刻，Myd88與Tollip的表達水平呈正相關(guān)(r3h=0.960, P3h＜0.05; r8h=0.844, P8h＜0.05; r24h=0.895, P24h＜0.05)。
　　結(jié)論:1、采用經(jīng)腹腔注入0.5mg/kg脂多糖，24小時后再次注入5mg/kg脂多糖的方法建立幼鼠內(nèi)毒素耐受