MyD88在癲癇活動中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分 MyD88在難治性癲癇患者及癲癇動物中的表達(dá)
　　目的：
　　越來越多的證據(jù)表明腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)是癲癇發(fā)生發(fā)展的重要病理生理機(jī)制。髓樣分化因子88（Myeloid differentiation factor88，MyD88）是細(xì)胞內(nèi)的接頭分子，在機(jī)體免疫和炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。本實驗首先在難治性顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）患者及急、慢性癲癇動物模型中測定MyD88的表達(dá)規(guī)律，以探

2、討癲癇活動是否影響MyD88的表達(dá)。
　　方法：
　　1.從本課題組建立的癲癇腦庫中隨機(jī)抽取25例難治性TLE患者和15例對照組患者的顳葉新皮質(zhì)；使用免疫熒光、免疫組化、和免疫印跡法測定MyD88的表達(dá)規(guī)律。
　　2.使用氯化鋰和皮羅卡品（25mg/kg）在SD大鼠中誘導(dǎo)急性癲癇發(fā)作模型，在癲癇發(fā)作后6h、24h、和72h，采用免疫熒光和免疫印跡法測定大鼠海馬及周圍皮質(zhì)中 MyD88的表達(dá)規(guī)律；建立急性戊四氮（pent

3、ylenetetrazol，PTZ）模型（65mg/kg），在PTZ注射后3h、6h、和24h，采用免疫印跡法測定大鼠海馬中MyD88的表達(dá)規(guī)律。
　　3.使用氯化鋰和皮羅卡品在SD大鼠中建立慢性TLE模型，在皮羅卡品注射2個月后，采用免疫組化和免疫印跡法在有慢性自發(fā)性癲癇發(fā)作（spontaneous recurrent seizures, SRS）大鼠的海馬及周圍皮質(zhì)中檢測 MyD88的表達(dá)規(guī)律；建立慢性 PTZ點燃模型，采用免

4、疫印跡法在點燃大鼠腦組織中測定MyD88的表達(dá)規(guī)律。
　　結(jié)果：
　　1. MyD88在難治性TLE患者腦組織中表達(dá)升高，主要表達(dá)于神經(jīng)元的胞漿中。
　　2.在急性皮羅卡品模型中，MyD88在癲癇發(fā)作后24h和72h表達(dá)升高，主要與神經(jīng)元共表達(dá)，沒有與膠質(zhì)細(xì)胞共表達(dá)；在急性PTZ模型中，MyD88在癲癇發(fā)作后6h和24h表達(dá)升高。
　　3.在慢性匹羅卡品模型中，在有SRS的大鼠海馬和皮質(zhì)中MyD88表達(dá)升高；在慢

5、性PTZ點燃模型中，MyD88在點燃大鼠海馬中表達(dá)也升高。
　　結(jié)論:
　　MyD88在難治性TLE患者和急、慢性癲癇大鼠腦組織中表達(dá)均升高，說明癲癇活動可影響MyD88的表達(dá)。
　　第二部分 MyD88在癲癇大鼠發(fā)作中的作用
　　目的：
　　為了測定MyD88對癲癇發(fā)作的影響，本部分在急性匹羅卡品和急性PTZ模型中測定MyD88的小分子抑制劑ST2825及刺激分子IL-1β對癲癇發(fā)作的影響。
　　方

6、法：
　　1.在急性皮羅卡品模型中，在皮羅卡品注射前20min側(cè)腦室注射不同劑量的MyD88抑制劑ST2825（2.5μg、5μg、10μg），在皮羅卡品注射后90min，觀察ST2825對癲癇發(fā)作的行為學(xué)影響，評價指標(biāo)為SE發(fā)生率、SE潛伏期、癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度、和累積發(fā)作評分。
　　2.在急性皮羅卡品模型中，在皮羅卡品注射前20min給予10μg ST2825，觀察其對腦電圖（electroencephalogram，EE

7、G）上癲癇發(fā)作的影響，評價指標(biāo)為EEG上第一次癲癇發(fā)作潛伏期、總的癲癇發(fā)作次數(shù)、和總的癲癇發(fā)作時間；檢測10μg ST2825對小膠質(zhì)細(xì)胞活化的影響。
　　3.在急性PTZ模型中，在PTZ（65mg/kg）注射前20min給予10μg ST2825，觀察其對癲癇發(fā)作的影響，評價指標(biāo)為第一次陣攣發(fā)作的潛伏期、全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的潛伏期、和全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的持續(xù)時間。
　　4.在急性皮羅卡品模型中，在皮羅卡品注射前20min給

8、予ST2825，前10min給予重組大鼠IL-1β，實驗分為溶劑組、IL-1β組，ST+IL-1β組，觀察IL-1β是否有促驚厥作用，及ST2825對IL-1β促驚厥作用的影響。
　　5.在急性PTZ模型中，在PTZ注射前20min給予ST2825，前10min給予重組大鼠IL-1β，實驗分為溶劑組、IL-1β組，ST+IL-1β組，觀察IL-1β是否有促驚厥作用，及ST2825對IL-1β促驚厥作用的影響。
　　結(jié)果：

9、r>　　1.在急性皮羅卡品模型中，側(cè)腦室注射5μg及10μg ST2825顯著延長SE潛伏期，減弱癲癇發(fā)作的嚴(yán)重程度，降低累積發(fā)作評分。
　　2.在急性皮羅卡品模型中，側(cè)腦室注射10μg ST2825顯著延長EEG上第一次癲癇發(fā)作的潛伏期，減少癲癇發(fā)作的總次數(shù)，縮短癲癇發(fā)作總的持續(xù)時間；此外，10μg ST2825顯著減輕由癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度。
　　3.在急性PTZ模型中，側(cè)腦室注射10μg ST2825顯著延

10、長第一次陣攣發(fā)作的潛伏期、延長全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的潛伏期、并縮短全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的持續(xù)時間。
　　4.在急性皮羅卡品模型中，側(cè)腦室注射1ng IL-1β顯著縮短SE潛伏期，加重癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度，增加累積發(fā)作評分；在IL-1β前10min給予ST2825，ST2825阻止IL-1β誘導(dǎo)的SE潛伏期縮短，減輕IL-1β誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作程度加劇，減弱IL-1β誘導(dǎo)的累積發(fā)作評分增加。此外，側(cè)腦室注射1ng IL-1β顯著縮短EEG上第一

11、次癲癇發(fā)作的潛伏期，增加總的癲癇發(fā)作時間；ST2825阻止IL-1β誘導(dǎo)的EEG上第一次發(fā)作潛伏期的縮短，減輕總的癲癇發(fā)作次數(shù)，減少IL-1β誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作時間的增加。
　　5.在急性PTZ大鼠模型中，i.c.v.1ng IL-1β顯著縮短全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的潛伏期并延長全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的持續(xù)時間。預(yù)先給予ST2825可阻斷IL-1β誘導(dǎo)的潛伏期縮短及全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作持續(xù)時間的增加。
　　結(jié)論:
　　1. MyD8

12、8的小分子抑制劑 ST2825在急性匹羅卡品模型中可減少行為學(xué)上及EEG上的癲癇發(fā)作，減輕小膠質(zhì)細(xì)胞的活化；ST2825在急性PTZ模型中也能減少癲癇發(fā)作。
　　2. IL-1β在急性皮羅卡品和急性 PTZ模型中均具有促驚厥作用， ST2825能抑制IL-1β的促驚厥作用。
　　第三部分 MyD88參與癲癇發(fā)作的機(jī)制探討
　　目的：
　　NR2B酪氨酸位點的磷酸化在NMDA受體功能和神經(jīng)元興奮性中發(fā)揮重要作用。上

13、部分的研究說明MyD88在癲癇活動中起重要作用，本部分對NR2B酪氨酸的磷酸化水平改變是否參與這個過程進(jìn)行探討。
　　方法：
　　1.采用免疫印跡法檢測NMDA亞基NR2B酪氨酸磷酸化位點1472（NR2B Tyr1472）在不同干預(yù)條件下的磷酸化水平改變，分組：vehicle組、Pilo組、IL-1β組、IL-1β+Pilo組、ST+IL-1β+Pilo組、和ST+Pilo組。
　　2.在急性皮羅卡品模型中，在匹羅卡

14、品注射前20min給予 NR2B Tyr1472的抑制劑艾芬地爾，在皮羅卡品10min前給予重組大鼠IL-1β，實驗分為 vehicle組、IL-1β組、Ifen組、和 Ifen+IL-1β組，觀察抑制NR2B Tyr1472后對IL-1β促驚厥作用的影響。
　　3.在急性 PTZ模型中，在 PTZ注射前20min給予艾芬地爾，在PTZ10min前給予重組大鼠IL-1β，實驗分為vehicle組、IL-1β組、Ifen組、和Ife

15、n+IL-1β組，觀察抑制NR2B Tyr1472后對IL-1β促驚厥作用的影響。
　　結(jié)果：
　　1.單獨(dú)給予IL-1β或癲癇發(fā)作本身（僅皮羅卡品）增加NR2B Tyr1472位點的磷酸化，分別增加154％和134%（P<0.05）。同時給予IL-1β和皮羅卡品時，與vehicle組相比，NR2B Tyr1472的磷酸化水平增加213%，說明 IL-1β和癲癇發(fā)作對其磷酸化水平增加具有疊加效應(yīng)。10μg ST2825顯著抑

16、制由癲癇發(fā)作引起的NR2B Tyr1472磷酸化水平增高（P<0.05）。此外，10μg ST2825有效阻止IL-1β+皮羅卡品誘導(dǎo)的NR2B Tyr1472磷酸化水平增高（P<0.01）。
　　2.在急性皮羅卡品模型中，側(cè)腦室注射1ng IL-1β顯著縮短SE潛伏期，加重癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度，增加累積發(fā)作評分；在IL-1β前10min給予NR2B Tyr1472的抑制劑艾芬地爾，艾芬地爾阻止IL-1β誘導(dǎo)的SE潛伏期縮短，緩和IL

17、-1β誘導(dǎo)的癲癇發(fā)作程度加劇，減弱IL-1β誘導(dǎo)的累積發(fā)作評分增加。
　　3.在急性PTZ模型中，與vehicle組相比，IL-1β組顯著縮短全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的潛伏期并延長全身強(qiáng)直-陣攣的持續(xù)時間。相反，與vehicle組相比，艾芬地爾顯著增加第一次陣攣發(fā)作和強(qiáng)直-陣攣發(fā)作的潛伏期，減少全身強(qiáng)直-陣攣的持續(xù)時間，具有抗驚厥作用。此外，艾芬地爾可阻斷 IL-1β誘導(dǎo)的潛伏期縮短和全身強(qiáng)直-陣攣發(fā)作持續(xù)時間的延長。
　　結(jié)論:

18、
　　1.在癲癇發(fā)作中，NR2B Tyr1472的磷酸化水平增高，IL-1β可使NR2B Tyr1472的磷酸化水平進(jìn)一步增高，ST2825可降低由癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的NR2B Tyr1472磷酸化水平的增加。
　　2. NR2B亞基的選擇性抑制劑艾芬地爾可抑制癲癇發(fā)作活動，并可抑制IL-1β的促驚厥作用。
　　第四部分 MyD88對癲癇形成的影響
　　目的：
　　越來越多的證據(jù)表明腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)在癲癇形成中起重

19、要作用，抗炎治療有可能成為抗癲癇形成治療的新策略。前部分的研究證實MyD88在癲癇發(fā)作中起重要作用，本部分進(jìn)一步研究 MyD88對癲癇形成的影響。
　　方法：
　　1.在SD大鼠中每天給予亞驚厥劑量的PTZ（33mg/kg）建立慢性PTZ點燃模型，IL-1β在PTZ前10min給予，ST2825在PTZ前20min給予，分Con組、vehicle組、IL-1β組、和ST2825組，記錄每次PTZ注射后癲癇發(fā)作的最高級別和達(dá)到

20、完全點燃的潛伏期，完全點燃是指大鼠在PTZ注射后連續(xù)3天達(dá)到4級或4級以上的癲癇發(fā)作。
　　2.在慢性皮羅卡品模型中，在 SE結(jié)束后24h，每天側(cè)腦室注射IL-1β和ST2825，每天一次，連續(xù)給予7天。實驗分為vehicle組、IL-1β組、和ST2825組。從 SE后的第21～34天，使用高清視頻系統(tǒng)監(jiān)測SRS活動。分析指標(biāo)為SRS發(fā)生率、SRS發(fā)作次數(shù)、和SRS發(fā)作嚴(yán)重程度。
　　結(jié)果：
　　1.在慢性 PTZ點

21、燃模型中，IL-1β組完全點燃的潛伏期與 vehicle組相比明顯縮短，IL-1β組的癲癇發(fā)作級別在第5、7～9、10、12天與vehicle組相比明顯加重。相反，ST2825組完全點燃的潛伏期與vehicle組相比明顯延長，ST2825組的癲癇發(fā)作級別在第6～8、13～18天明顯減輕。此外，Con組與vehicle組相比，達(dá)到完全點燃的潛伏期及癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度沒有明顯差別。
　　2.在慢性皮羅卡品模型中，SRS發(fā)生率在 vehi

22、cle組、IL-1β組、和ST2825組沒有明顯差異。與vehicle組相比，IL-1β組SRS每天發(fā)作次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），ST2825組 SRS每天發(fā)作次數(shù)差別不顯著（p>0.05）。與vehicle組相比，SRS的嚴(yán)重程度在IL-1β組明顯增加（p<0.05），而在ST2825組差別不顯著（p>0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.在慢性PTZ點燃模型中，IL-1β可縮短PTZ完全點燃的潛伏期，并