抑制MyD88促進小鼠心臟與皮膚移植耐受及其機理.pdf

1、本文主要從以下三個方面展開論述：
　　第一部分 MyD88抑制劑TJ-M2010對樹突狀細胞生物學功能的影響
　　目的：探究新型MyD88抑制劑TJ-M2010對體外培養(yǎng)的小鼠骨髓來源樹突狀細胞共刺激分子表達、吞噬功能、遷移能力、凋亡、刺激T細胞增殖等生物學功能方面的影響。
　　方法：體外誘導培養(yǎng)得到BALB/c小鼠不成熟骨髓源性 DC（bone marrow-derived dendritic cells, BMDC

2、s），分為四組：空白組（不做任何處理），CpG刺激組，CPG刺激+低濃度TJ-M2010組（20μM），CpG刺激+高濃度TJ-M2010組（40μM）。孵育24小時后流式檢測DC共刺激分子CD80、CD86及MHCⅡ和趨化因子受體CCR7的表達；westblot的方法檢測NF-κB在細胞核內的表達；收集上述經不同濃度TJ-M2010處理的BALB/c BMDC，與CFSE標記的C57小鼠T細胞體外在CpG刺激下行混合淋巴細胞培養(yǎng)，3天

3、后流式檢測 T細胞增殖情況。BALB/c BMDC中加入不同濃度TJ-M2010，利用FITC-Dextran法檢測DC吞噬功能，利用Annexin-Ⅴ-PI雙染法檢測DC凋亡及壞死情況。
　　結果：流式結果顯示：DC經CpG刺激后高表達 CD80/CD86/MHCⅡ（53.1±0.3％/55.6±3.5％/64.6±4.3％）。20μM、40μM TJ-M2010分別下降上述分子水平至（CD80：38.2％±2.2％,20.7％

4、±1.1％； CD86：40.4％±1.6％,26.3±1.5％； MHCⅡ：45.1％±2.4％,28.1±3.4％，p<0.05,vs CpG對照組）。DC經CpG刺激后CCR7表達率由25.43％上升至46.86％，20μM、40μM TJ-M2010分別使 CCR7下降至36.07％和27.20％。TJ-M2010能夠劑量依賴性的抑制由 CpG引起的NF-κB p65的核轉位。TJ-M2010能夠劑量依賴性地抑制 BMDC與同種

5、反應性 T細胞混合淋巴細胞培養(yǎng)中CD3+CFSE+T細胞比例。空白組DC吞噬FITC-Dextran陽性率為63.4％±3.4％，20μM、40μM TJ-M2010與 DC共孵育后，其 FITC-Dextran陽性率未見明顯改變，分別為65.7％±2.6％和62.6％±2.6％(p>0.05， vs空白組）。空白組 DC培養(yǎng)24小時后Annexin-Ⅴ-PI雙陽細胞比例為：6.6％±0.9％，20μM、40μM TJ-M2010與DC

6、共孵育后， Annexin-Ⅴ-PI雙陽細胞比例未見明顯改變，分別為：6.5％±1.1％和6.6％±1.1％（p>0.05，vs空白組）。
　　結論：TJ-M2010能夠劑量依賴性地抑制CpG引起的DC的成熟、高遷移能力及NF-κB活化，并能夠劑量依賴性地間接抑制同種反應性T淋巴細胞增殖；TJ-M2010不影響DC吞噬功能，對DC也為見明顯細胞毒性作用。
　　第二部分 MyD88抑制劑TJ-M2010促進小鼠同種異基因心臟移

7、植耐受及機制
　　目的：探討MyD88抑制劑TJ-M2010在誘導小鼠同種異基因心臟移植耐受中的作用及其可能的機制。
　　方法：（1）建立BALB/c(H-2d)→C57BL/6(H-2b)的小鼠腹部心臟移植模型。實驗分為三組：空白對照組，CMC溶媒對照組及TJ-M2010用藥組。TJ-M2010用0.5％羧甲基纖維素鈉（Carboxymethyl cellulose，CMC）混懸，腹腔注射給藥；對照組使用相同劑量的0.5％

8、 CMC腹腔注射。手術當天記為Day0，TJ-M2010給藥方案為：Day-2~ Day7連續(xù)每天給藥，劑量50mg/kg/天。術后每天捫診移植心臟，觀察移植物存活時間。（2）術后7天獲取移植心，HE染色檢測各組移植物病理改變；利用Ⅱ型膠原酶消化移植物獲得移植物中單個核細胞，流式檢測 CD11c+CD80+雙陽細胞比例；實時定量熒光PCR檢測移植心中IL-1、IL-6、TNF-αmRNA水平。（3）流式細胞術檢測移植心長期存活小鼠脾臟中

9、CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞比例；分離各組脾臟細胞，INF-γELISPOT檢測各組脾臟細胞抗原反應性。（4）二次心臟移植：對移植物長期存活小鼠行供者來源二次頸部心臟移植，觀察二次移植物存活時間。
　　結果：空白對照組（n=5）移植心存活時間MST為7.4±0.5天，CMC溶媒對照組（n=5）移植物MST為7.6±0.5天，無統(tǒng)計學差異（p>0.05）。而TJ-M2010組可使50％的移植心存活時間超過100天。對

10、移植物長期存活的受者行二次心臟移植，受者可持續(xù)不排斥BALB/c心臟（>100天）。術后7天移植物病理顯示TJ-M2010組淋巴細胞浸潤、組織破壞等排斥反應明顯輕于CMC對照組。實時定量熒光PCR示：與CMC溶媒對照組相比，TJ-M2010組移植心中IL-1、IL-6、TNF-αmRNA水平明顯降低（p<0.05）。同時TJ-M2010組移植心中單個核細胞CD11c+CD80+雙陽細胞比例明顯低于CMC對照組。脾臟中Treg比例：CMC

11、對照組Treg比例為6.43％，TJ-M2010組Treg比例升高至12.92％。INF-γ ELISPOT顯示： TJ-M2010組移植物長期存活小鼠脾臟細胞對C3H抗原反應正常（p>0.05, VS未做心臟移植的B6脾臟細胞），而對BALB/c抗原反應性明顯降低（p<0.05, VS未做心臟移植的B6脾臟細胞）。
　　結論：單獨短期應用MyD88抑制劑TJ-M2010能夠誘導供者特異性小鼠心臟移植耐受，機制上可能與減輕炎性因子

12、分泌、誘導調節(jié)性T細胞等有關。
　　第三部分 MyD88抑制劑TJ-M2010聯(lián)合anti-CD154誘導小鼠同種異基因皮膚移植耐受
　　目的：探討MyD88抑制劑TJ-M2010聯(lián)合anti-CD154誘導小鼠同種異基因皮膚移植耐受的可能性及其機制。
　　方法:建立BALB/c(H-2d)→C57BL/6(H-2b)的小鼠皮膚移植模型。實驗分為三組：TJ-M2010用藥組，anti-CD154組，TJ-M2010+a

13、nti-CD154組。手術當天記為Day0， TJ-M2010給藥方案為：Day-2-Day7，Day9，Day11， Day13， Day15，腹腔注射，劑量50mg/kg/天。Anti-CD154(MR1 clone)給藥方案：Day0-Day3， Day7， Day14，腹腔注射，劑量200ug/只/次。以移植皮片完全壞死判斷為排斥時間點，觀察各組移植物存活時間。對移植物長期存活小鼠行供者（BALB/c）及第三方（C3H）來源二次

14、皮膚移植或心臟移植，觀察二次移植物存活時間。分離移植物長期存活小鼠脾臟中單個核細胞，流式檢測CD4+CD25+Foxp3+ Treg細胞比例； INF-γELISPOT檢測各組脾臟細胞對供者（BALB/c）及第三方（C3H）抗原反應性。
　　結果：TJ-M2010用藥組及anti-CD154組皮膚移植物存活時間分別為（9.0±0.71）天與（9.6±0.55）天，兩組之間無顯著統(tǒng)計學差異（p>0.05），而TJ-M2010+ant

15、i-CD154組可使22％的皮膚移植物長期存活（>100天）。對移植物長期存活的小鼠行二次心臟移植，心臟移植物全部長期存活（>100天）；二次皮膚移植，BALB/c來源皮膚移植物存活時間為(16±1.4)天，C3H來源皮膚移植物存活時間為（13.5±0.7）天；行二次皮膚移植受體同時短期給予TJ-M2010，則BALB/c皮膚移植物存活時間可延長至41天、72天（n=2）。脾臟中Treg比例：與對照組相比，TJ-M2010+anti-C

16、D154組Treg比例明顯升高。TJ-M2010+ anti-CD154組移植物長期存活小鼠脾臟對C3H抗原反應正常（p>0.05, VS未做皮膚移植的B6脾臟細胞），而對BALB/c抗原反應性明顯降低（p<0.05, VS未做皮膚移植的B6脾臟細胞）。
　　結論：MyD88抑制劑TJ-M2010聯(lián)合anti-CD154可以誘導小鼠同種異基因皮膚移植耐受，此種耐受是一種不穩(wěn)定的耐受狀態(tài)，而MyD88分子在此種耐受的維持中發(fā)揮重要作