羅非魚髓樣分化因子(MyD88)的克隆與表達分析.pdf

1、髓樣分化因子（MyD88）是IL-1R/TLR信號通路（TLR3除外）的關(guān)鍵接頭蛋白，可激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的產(chǎn)生，在天然免疫中具有重要作用。羅非魚作為重要的世界性養(yǎng)殖魚類，有關(guān)MyD88及其介導的信號通路相關(guān)因子的研究尚未見報道。本文通過RACE-RCR技術(shù)克隆了奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚MyD88基因，對其進行生物信息學分析，并利用熒光定量PCR技術(shù)檢測兩種羅非魚MyD88在不同組織中的表達。
　　 序列分析表明奧利亞

2、羅非魚MyD88 eDNA序列全長1611bp，5'UTR為155bp，3'UTR為589 bp;尼羅羅非魚MyD88基因全長為1572 bp，5'UTR為118 bp，3' UTR為587 bp;開放閱讀框長度均為867 bp，共編碼288個氨基酸。奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚MyD88核苷酸序列相似性高達99％。利用在線軟件SMART程序?qū)ν茖У陌被嵝蛄蟹治銎涔δ芙Y(jié)構(gòu)域，其結(jié)果表明，羅非魚MyD88蛋白具有典型的MyD88結(jié)構(gòu)，具有N

3、端的死亡結(jié)構(gòu)域，中間的連接結(jié)構(gòu)域和C末端的TIR結(jié)構(gòu)域;其中TIR結(jié)構(gòu)域包含三個高度保守的區(qū)域:box1(FDAFICYCQ)，box2(LCVFDRDVLPGSC)，和box3(FWTRL)。同源性分析表明，羅非魚MyD88與其他物種MyD88之間有較高的氨基酸和編碼區(qū)序列相似性，與鱖魚氨基酸相似性高達85.8％，核苷酸相似性為84.7％，與其他魚類核苷酸相似性為69％～82％，與哺乳動物核苷酸相似性為63％～64％;與無脊椎動物扇貝

4、（核苷酸相似性31.8％,氨基酸相似性9.2％）、果蠅（核苷酸相似性21.9％，氨基酸相似性3.3％）的序列相似性最低。系統(tǒng)進化樹分析表明，魚類MyD88聚為一支，與無脊椎動物距離較遠;羅非魚MyD88與同屬鱸形目的鱖魚、大黃魚聚在一起，具有很近的親緣關(guān)系。
　　 為對羅非魚MyD88進行組織定量檢測，根據(jù)所測羅非魚MyD88基因序列設(shè)計并合成特異性引物，以β-actin為內(nèi)參基因，建立了以SYBR Green染料為熒光指示劑的

5、MyD88實時定量PCR方法。實驗以尼羅羅非魚肝臟組織eDNA為標準樣品，進行5倍梯度稀釋，分別以3次平行重復和5個連續(xù)梯度稀釋樣品進行擴增，根據(jù)所得到的標準曲線對兩基因PCR擴增效率進行判定。結(jié)果表明，MyD88和β-actin基因的擴增效率分別為100％和96.7％，相關(guān)系數(shù)分別為0.998和0.995;擴增產(chǎn)物均形成單一的特異性熔解峰;而且MyD88和β-actin基因標準曲線斜率差小于0.1，可認為其擴增效率基本一致，滿足應用2

6、-△△Ct分析法進行相對定量分析羅非魚MyD88表達的條件。為驗證所建立的熒光實時定量PCR平臺，應用相對定量2-△△Ct分析方法初步檢測了尼羅羅非魚肝臟、脾臟、血液和肌肉組織的相對表達量。組織相對定量初步分析結(jié)果顯示，MyD88基因在參與機體免疫的相關(guān)組織肝臟、脾臟和血液中高豐度表達，在肌肉組織中表達量較低。
　　 利用所建立的定量檢測羅非魚MyD88表達平臺，對健康奧利亞羅非魚和尼羅羅非魚12種不同組織MyD88表達情況進行

7、分析，分別進行3次生物學重復測定，并用Graphpad Prism5 Demo軟件進行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示，MyD88在所有被測組織中均有表達，奧利亞羅非魚與尼羅羅非魚MyD88各組織表達分布情況基本一致:在卵巢中表達水平最高，其次是小腸、脾臟、肝臟、腎臟、鰓和血液，肌肉、精巢組織中MyD88的表達水平最低。
　　 本文對羅非魚MyD88基因及其表達做了初步研究，推測羅非魚MyD88功能相似于其他魚類及哺乳動物，參與機體免疫反應。