組織蛋白酶D功能抑制在α-synuclein降解障礙中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：探討組織蛋白酶D(cathepsin D)在帕金森病動(dòng)物模型中腦黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中功能抑制導(dǎo)致α-synuclein聚積的機(jī)制；初步探索多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞中cathepsin D的調(diào)控機(jī)制。
　　方法：在魚藤酮皮下注射Lewis大鼠（8周）制備的帕金森大鼠模型和魚藤酮（500nM）干預(yù)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞模型基礎(chǔ)上，免疫熒光和免疫印跡法檢測魚藤酮引起的多巴胺能神經(jīng)元受損，溶酶體標(biāo)記蛋白LAMP-1的表達(dá)情況，α

2、-synuclein和cathepsin D蛋白表達(dá)狀態(tài)改變，RT-PCR和real-time PCR法檢測mRNA水平，并檢測魚藤酮對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞中cathepsin D酶活性的影響。將慢病毒構(gòu)建的cathepsin D RNA干擾（LV-ctsd-RNAi-GFP）通過立體定位法注射到大鼠腦內(nèi)黑質(zhì)致密部，免疫熒光法檢測病毒感染位置和效率，Western blot檢測LV-ctsd-RNAi對(duì)多巴胺能神經(jīng)元存活及cathepsi

3、n D蛋白和α-synuclein蛋白表達(dá)狀態(tài)的影響。在SH-SY5Y細(xì)胞中給予慢病毒構(gòu)建的cathepsin D干擾處理后，熒光顯微鏡觀察病毒感染率；CCK-8檢測LV-ctsd-RNAi對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響；Western blot檢測LV-ctsd-RNAi對(duì)細(xì)胞中cathepsin D蛋白和α-synuclein蛋白表達(dá)的影響。在SH-SY5Y細(xì)胞和cathepsin D基因被敲低的SH-SY5Y細(xì)胞中，采用自噬誘導(dǎo)劑海藻糖（T

4、rehalose）誘導(dǎo)自噬后，給予魚藤酮干預(yù)，使被魚藤酮阻滯的自噬流得到部分恢復(fù)，比較兩種細(xì)胞中自噬底物蛋白的水平，研究cathepsin D在自噬溶酶體通路中的作用。組織蛋白酶L(Cathepsin L)特異性抑制劑Z-FY-CHO預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞后，魚藤酮干預(yù)細(xì)胞，Western blot檢測細(xì)胞內(nèi)cathepsin L，cathepsin D，以及自噬底物蛋白LC3II、P62和α-synuclein的蛋白水平，初步研究c

5、athepsin L對(duì)cathepsin D的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：魚藤酮長期皮下給藥能導(dǎo)致Lewis大鼠中腦黑質(zhì)區(qū)TH陽性細(xì)胞丟失，發(fā)生病變的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)有大量α-synuclein聚積，成熟cathepsin D蛋白水平降低，同時(shí)溶酶體標(biāo)記物L(fēng)AMP-1表達(dá)顯著降低，且cathepsin D表達(dá)減少的神經(jīng)元內(nèi)α-synuclein聚積明顯。體外模型中，魚藤酮明顯上調(diào)α-synuclein蛋白水平，降低成熟cathepin

6、D的蛋白水平和cathepsin D酶活性，但α-synuclein和cathepin D的mRNA水平都未見明顯變化。慢病毒介導(dǎo)的cathepsin D基因干擾，成功敲低 Lewis大鼠多巴胺能神經(jīng)元和SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)的cathepsin D表達(dá)水平，且影響神經(jīng)元的生存和細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步導(dǎo)致α-synuclein蛋白蓄積。Cathepsin D基因干擾加重了魚藤酮誘導(dǎo)的自噬底物蛋白堆積。Cathepsin L抑制劑能減輕魚藤酮對(duì)