組織蛋白酶C在牙周炎癥反應(yīng)中的功能初探.pdf

1、掌跖角化-牙周破壞綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome，PLS）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，嚴重的早發(fā)性牙周炎是其主要的臨床表現(xiàn)之一?；颊咄ǔＴ谌檠榔诩窗l(fā)病，炎癥一直持續(xù)至恒牙期，最終可導(dǎo)致牙齒脫落。多數(shù)患者還可同時伴有掌跖、膝蓋等部位皮膚的角化異常。目前研究已經(jīng)證實，組織蛋白酶C基因（cathepsin C gene，CTSC）突變是PLS的致病基礎(chǔ)，但是具體機制尚不清楚。
　　組織蛋白酶C，又稱二肽肽

2、酶I（Dipeptidyl peptidase I，DPPI）是一類溶酶體半胱氨酸蛋白酶，參與機體細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的降解?，F(xiàn)有的研究表明，組織蛋白酶 C對激活殺傷性T細胞（又稱細胞毒性T淋巴細胞，Cytotoxic T lymphocyte，CTL）中粒酶A和粒酶B，從而使CTL發(fā)揮正常的免疫功能有重要作用，因此CTSC突變導(dǎo)致的組織蛋白酶 C異常表達可能會導(dǎo)致機體抗感染能力減弱，從而引發(fā)和加重炎癥反應(yīng)。但是，關(guān)于組織蛋白酶C表達異常所造成

3、的PLS臨床病損為何會主要集中在牙周組織的破壞以及多部位上皮的角化異常，其原因和機制目前尚無合理解釋。探究組織蛋白酶C在牙周炎癥反應(yīng)中的功用，對于明確PLS的發(fā)病及牙周組織的自我保護機制具有重要意義。
　　研究目的：
　　1.觀察不同狀態(tài)下牙齦上皮細胞中組織蛋白酶C的表達差異，初步探討其與上皮細胞分化、免疫功能的關(guān)系；
　　2.通過基因敲除小鼠探討CTSC缺失對牙周組織炎癥反應(yīng)的影響，進一步明確組織蛋白酶C在牙周組織炎

4、癥反應(yīng)中可能承擔(dān)的角色。
　　研究方法：
　　1.探究不同狀態(tài)下牙齦組織中組織蛋白酶C表達變化：
　　采用Real-time PCR方法檢測并比較健康牙齦、牙齦炎牙齦以及牙周炎牙齦組織中CTSC基因表達的差異；采用免疫組織化學(xué)法檢測并比較上述3種狀態(tài)下組織蛋白酶C表達的差異。
　　2.探究牙齦上皮組織中組織蛋白酶C表達變化與上皮細胞分化的關(guān)系：
　　利用免疫組化染色觀察比較人健康牙齦、牙齦炎牙齦以及牙周炎牙

5、齦的上皮分化相關(guān)指標(biāo)CK10、CK19的表達情況并分析其與相同狀態(tài)下組織蛋白酶C表達的相關(guān)性。
　　3.探究牙齦上皮組織中組織蛋白酶C的表達變化與上皮細胞免疫的關(guān)系：
　　利用免疫組化染色觀察比較人健康牙齦、牙齦炎牙齦以及牙周炎牙齦的 Toll樣受體4（Toll like receptor4，TLR4）的表達情況并分析其與相同狀態(tài)下組織蛋白酶C表達的相關(guān)性。
　　4.建立小鼠牙周炎模型并觀察牙周炎癥反應(yīng)：
　　采

6、用向CTSC基因敲除C57小鼠和野生型C57小鼠的牙周組織局部注射大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）的方法建立小鼠切牙牙周炎模型及磨牙牙周炎模型。Micro-CT掃描，進行切牙區(qū)牙槽骨體積以及磨牙區(qū)牙槽骨高度的變化量分析；HE染色觀察比較CTSC基因敲除鼠和野生型鼠牙周組織的炎癥水平，并進行差異分析。
　　研究結(jié)果：
　　1. Real-time

7、 PCR結(jié)果顯示：
　　牙齦炎和牙周炎狀態(tài)下牙齦組織中 CTSC的表達量顯著高于健康狀態(tài)下牙齦組織中CTSC表達量；牙齦炎和牙周炎組織中CTSC基因的表達量未見明顯差異。免疫組化結(jié)果顯示：健康狀態(tài)下，組織蛋白酶 C在牙齦上皮中僅有散在地少量表達，而牙齦炎和牙周炎狀態(tài)下牙齦組織中組織蛋白酶 C的表達陽性率明顯增加，且表達位置主要位于牙齦上皮的基底上層，尤其是上皮表層表達最強，結(jié)締組織內(nèi)幾乎沒有組織蛋白酶C表達；牙齦炎和牙周炎組組織蛋

8、白酶C陽性表達細胞比例及表達強度無顯著差異。
　　2.免疫組化結(jié)果顯示：
　　在牙周發(fā)生炎癥反應(yīng)時，伴隨 CTSC表達增高的同時，上皮細胞的分化發(fā)生了改變，CK19在基底上層出現(xiàn)散在的表達，CK10的表達則明顯增加，且與CTSC表達變化趨勢同步，提示組織蛋白酶C可能與上皮分化功能的改變有關(guān)。
　　3.免疫組化結(jié)果顯示：
　　與CTSC的變化趨勢類似，在牙周炎癥時，TLR4在牙齦上皮的表達明顯增加，且主要集中于上皮

9、表層位置，提示組織蛋白酶 C可能與上皮免疫功能的發(fā)揮存在一定關(guān)系。
　　4.對CTSC基因敲除鼠和野生型鼠建模后，通過比較小鼠切牙區(qū)實驗前后及磨牙區(qū)實驗側(cè)和對照側(cè)牙槽骨的骨量及高度，結(jié)果令人驚訝。與人類不同，野生型鼠相比建模前，牙槽骨骨量及高度均發(fā)生了明顯的降低，而 CTSC基因敲除鼠未見明顯變化。HE染色結(jié)果顯示：野生型鼠牙周組織中有大量的炎性細胞浸潤，并且牙槽骨以及牙周膜纖維的破壞程度也明顯高于 CTSC基因敲除鼠。免疫組化結(jié)

10、果顯示：野生型鼠牙周組織中表達NF-κB的細胞數(shù)明顯多于CTSC基因敲除鼠。故，組織蛋白酶C缺失在小鼠牙周發(fā)生炎癥時，反而對牙周組織產(chǎn)生一種“保護”作用。
　　通過進一步的免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CTSC在人類和鼠的牙周組織中表達模式存在差異，人牙齦上皮的組織蛋白酶 C主要表達于基底上層，尤其是近表皮層；而在鼠牙齦組織中，組織蛋白酶C主要表達于上皮的基底層以及臨近基底的部分基底上層，表皮層未見明顯表達，這可能與CTSC基因敲除小鼠體內(nèi)出

11、現(xiàn)的牙周保護作用存在一定關(guān)系。
　　結(jié)論：
　　1.組織蛋白酶C在炎癥狀態(tài)的牙齦上皮細胞中表達明顯增強，說明其在牙周組織的炎癥反應(yīng)中具有重要的作用。
　　2．組織蛋白酶C在牙齦上皮細胞中的表達變化，伴隨著細胞分化狀態(tài)和上皮細胞免疫狀態(tài)的改變。
　　3. CTSC基因缺失對小鼠炎癥刺激下誘導(dǎo)牙周組織發(fā)生破壞可能具有一定的“保護”作用，而CTSC基因缺失對人牙周炎癥反應(yīng)具有截然相反的影響，這種不同結(jié)局的造成可能與CT