家蠶組織蛋白酶基因家族結(jié)構(gòu)分析及功能初探.pdf

1、昆蟲體內(nèi)存在多種蛋白酶，主要發(fā)揮蛋白水解功能，如昆蟲卵內(nèi)蛋白酶在昆蟲胚胎發(fā)育過程中降解卵黃蛋白質(zhì)，供給胚胎發(fā)育必需的氨基酸，對(duì)胚胎發(fā)育具有重要的作用。另外蛋白酶對(duì)昆蟲的發(fā)育變態(tài)具有十分重要的作用，因此倍受矚目。昆蟲體內(nèi)的組織蛋白酶已有很多報(bào)道，從20世紀(jì)60年代至今，已對(duì)家蠶、果蠅、棉鈴蟲、蝗蟲和蚊子等數(shù)種昆蟲的蛋白酶進(jìn)行了研究，所報(bào)道的蛋白酶大多屬于半胱氨酸、絲氨酸和天冬氨酸蛋白酶類。家蠶是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和模式生物，2003年，中國家

2、蠶基因組框架圖的聞世給我們提供了大量重要信息，雖然已有部分家蠶蛋白酶作了報(bào)道，但是家蠶中蛋白酶具體的種類，除了報(bào)道的蛋白酶另外否還有新的蛋白酶，蛋白酶在家蠶中的組織分布和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況，以及蛋白酶在家蠶中的具體生理功能是怎樣的，這些問題引導(dǎo)著我們繼續(xù)對(duì)家蠶蛋白酶進(jìn)行研究。 本論文在家蠶基因組框架圖的基礎(chǔ)上，采用生物信息學(xué)分析方法，利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫和EST數(shù)據(jù)庫，廣泛調(diào)查了存在于家蠶中的組織蛋白酶的種類以及在家蠶中的組織分

3、布和不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，另外對(duì)新的組織蛋白酶D基因進(jìn)行了克隆和生物學(xué)信息分析；并運(yùn)用RNAi實(shí)驗(yàn)方法初步探索組織蛋白酶B在家蠶中的功能。本論文的研究工作主要分為以下幾部分： 1.根據(jù)基因組數(shù)據(jù)預(yù)測：家蠶包括13個(gè)蛋白酶基因(編號(hào)：Bmb028908、Bmb029117、Bmb011691、Bmb024796，Bmb011691、Bmb024796、Bmb028908，Bmb013888，Bmb008297，Bmb029952

4、、Bmb015815，Bmb020327，Bmb032550)，分為組織蛋白酶B、D、L、O、、S、F、K等7種類型，經(jīng)EST證據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，主要的家蠶組織蛋白酶類型是組織蛋白酶B、組織蛋白酶D和組織蛋白酶L；組織蛋白酶L(Bmb021457)已有序列報(bào)道，組織蛋白酶B(Bmb011691)文章已經(jīng)報(bào)道。 2.家蠶組織蛋白酶基因的時(shí)期表達(dá)：組織蛋白酶B，組織蛋白酶D和和組織蛋白酶L的絕大多數(shù)基因在時(shí)期表達(dá)中都檢測到mRNA，

5、時(shí)期主要包括：未受精卵，產(chǎn)卵24h，三齡，五齡3天，五齡7天，上簇，化蛹。所有時(shí)期都有表達(dá)的包括：組織蛋白酶BBmb028908、Bmb011691、Bmb024796，組織蛋白酶LBmb021457、Bmb023791和組織蛋白酶DBmb008297，另外，在未受精卵、產(chǎn)卵后48h胚胎和戊期胚胎內(nèi)檢測到大小分別為1.0kb和1.1kb兩種類型的組織蛋白酶DmRNA，推測發(fā)生了選擇性拼接；個(gè)別時(shí)期有表達(dá)的有：組織蛋白酶LBmb03272

6、0在卵期未檢測到mRNA，組織蛋白酶SBmb013888只在上簇和蛹期檢測到mRNA。 3.家蠶組織蛋白酶基因的組織分布：組織蛋白酶B，組織蛋白酶D和組織蛋白酶L有不同程度的表達(dá)差異。組織主要包括：五齡第3天的血，中腸，絲腺，脂肪體，精巢，卵巢。在所有組織中都有表達(dá)的有：組織蛋白酶BBmb011691，組織蛋白酶LBmb023791，組織蛋白酶DBmb008297；個(gè)別組織中有表達(dá)的：組織蛋白酶BBmb024796和Bmb028

7、908只在精巢中表達(dá)；組織蛋白酶LBmb032720在血液和脂肪體中沒有表達(dá)，Bmb021457在血液中沒檢測到mRNA；組織蛋白酶SBmb013888在脂肪體，精巢，卵巢中有表達(dá)。 所有時(shí)期和組織中都沒有檢測到表達(dá)的基因有：組織蛋白酶KBmb020327、組織蛋白酶FBmb032550、組織蛋白酶OBmb015815、Bmb029952和組織蛋白酶LBmb029117。 4.克隆組織蛋白酶D(Bmb008297)，設(shè)計(jì)

8、特異引物，通過拼接、測序，獲得到組織蛋白酶D基因(Bmctd,Bmb008297)的完整DNA序列，重點(diǎn)對(duì)組織蛋白酶D基因的同源性，分子量，功能位點(diǎn)，等電點(diǎn)，親疏水性，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)作生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明：Bmctd基因編碼區(qū)序列1152bp,384個(gè)氨基酸，Genebank登錄號(hào)DQ010007，與登錄號(hào)為AY297160的組織蛋白酶D基因序列相似性很高。 5.組織蛋白酶B(Bmb011691)的RNAi實(shí)驗(yàn)，對(duì)Bmctb進(jìn)

9、行TA克隆，用RibomaxTMLargeScaleRNAProductionSystem-T7(Promega)和RibomaxTMLargeScaleRNAProductionSystem-SP6(Promega)兩種試劑盒合成dsRNAs和siRNA，在幼蟲成熟第一天，顯微注射dsRNAs和siRNA，以Bmwh3dsRNA作對(duì)照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)注射高濃度的dsRNAs和siRNA會(huì)導(dǎo)致蠶直接死亡，中濃度的導(dǎo)致蠶不能完成其從幼蟲到蛹的轉(zhuǎn)