日糧纖維對(duì)豬體糞臭素沉積的調(diào)控及分子機(jī)理研究.pdf

1、糞臭素(3-甲基吲哚)是豬大腸內(nèi)微生物降解L-色氨酸的產(chǎn)物,是引起公豬膻味的主要物質(zhì)之一,易在脂肪組織中沉積,對(duì)豬肉風(fēng)味有負(fù)面作用。本論文在研究豬體內(nèi)糞臭素沉積規(guī)律的基礎(chǔ)上(第一部分),研究了不同發(fā)酵類型的纖維物質(zhì)對(duì)豬直腸菌群作用下L-色氨酸體外代謝的影響(第二部分),并通過動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步研究了纖維源對(duì)豬腸道糞臭素產(chǎn)生和組織沉積水平的影響,從腸道微生物區(qū)系組成和肝臟糞臭素代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)兩個(gè)層次,探討了纖維物質(zhì)調(diào)控豬體糞臭素水平的機(jī)制

2、(第三部分)。
　　 第一部分:豬體糞臭素沉積的時(shí)空變化規(guī)律研究,包括2個(gè)試驗(yàn)。
　　 試驗(yàn)一研究不同生長(zhǎng)階段豬體糞臭素沉積規(guī)律,并結(jié)合肝臟細(xì)胞色素P4502E1(CYP2E1)和P4502E1(CYP2A6)基因表達(dá)水平探討細(xì)胞色素P450酶系在調(diào)控糞臭素代謝上的作用。以30、90和150d的長(zhǎng)白豬為對(duì)象,測(cè)定了豬體不同組織和血漿中糞臭素和吲哚水平、肝臟中CYP2E1和CYP2A6 tuRNA表達(dá)水平和酶活。結(jié)果顯示,

3、隨著年齡的增長(zhǎng),血漿和肝臟中糞臭素水平顯著增加(P＜0.05)；背脂中糞臭素水平呈增加趨勢(shì)(P=0.061)；腹脂中糞臭素水平從30d到90d顯著增加(P＜0.05)。相似地,血漿、肝臟和脂肪中吲哚水平也隨著日齡的增長(zhǎng)而升高。除血漿外,組織中吲哚水平150d均顯著高于30d。CYP2E1和CYP2A6 mRNA表達(dá)豐度先降低后升高,150d的表達(dá)量顯著高于30d和90d(P＜0.05):但其酶活性沒有明顯差異。結(jié)果提示,在達(dá)到性成熟前豬

4、體糞臭素沉積水平與CYP2E1和CYP2A6基因的表達(dá)無(wú)確定關(guān)系。
　　 試驗(yàn)二研究豬不同腸段糞臭素的產(chǎn)生規(guī)律,并結(jié)合腸道微生物區(qū)系組成以探討與糞臭素生成相關(guān)的微生物學(xué)信息。選擇150d純種金華和長(zhǎng)白公豬各3頭,屠宰后迅速分離大腸,結(jié)扎為盲腸(Ce)、近結(jié)腸(PC)、遠(yuǎn)結(jié)腸(DC)和直腸(Re)四段,測(cè)定食糜中吲哚物質(zhì)及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)濃度,采用變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析腸道微生物區(qū)系組成,并測(cè)定結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖和凋

5、亡。結(jié)果發(fā)現(xiàn),金華豬和長(zhǎng)自豬腸道糞臭素和吲哚濃度從盲腸到直腸均逐漸上升,長(zhǎng)白豬近結(jié)、遠(yuǎn)結(jié)和直腸濃度顯著高于盲腸中的濃度(P＜0.05),長(zhǎng)白豬直腸中的濃度顯著高于金華豬(P＜0.05)。換言之,腸段因素對(duì)糞臭素和吲哚的濃度有顯著影響(P＜0.001),而品種沒有顯著影響,也不存在兩者互作。長(zhǎng)白豬直腸中支鏈脂肪酸比例(BCP)顯著升高(P＜0.05),金華豬和長(zhǎng)白豬腸道中總的吲哚物質(zhì)濃度與BCP的變化規(guī)律基本一致。兩個(gè)品種豬結(jié)腸細(xì)胞增殖和

6、凋亡指數(shù)均沒有顯著差別。在金華豬糞臭素濃度較高的近結(jié)、遠(yuǎn)結(jié)和直腸樣品出現(xiàn)的條帶與Clostridium aminophium匹配。結(jié)果提示,不同個(gè)體及不同腸段微生物區(qū)系差別較大,發(fā)酵模式亦不同,可能是糞臭素濃度產(chǎn)生差別的主要因?yàn)?。?xì)菌Caminophium可能在糞臭素的產(chǎn)生中起作用。
　　 第二部分:利用體外發(fā)酵技術(shù),研究不同纖維來(lái)源對(duì)豬直腸細(xì)菌群作用下L-色氨酸體外代謝的影響。
　　 試驗(yàn)三探討四種不同發(fā)酵類型的纖維物

7、質(zhì)對(duì)豬直腸菌群作用下L-色氨酸體外代謝生成糞臭素和吲哚的影響。將10％(w/v)糞水厭氧分裝于無(wú)菌培養(yǎng)瓶中,分成5組:對(duì)照組添加250μML-色氨酸,甜菜粕(SBP)、黑麥草(RYE)、苜蓿粉(ALF)和果寡糖(FOS)組分別在對(duì)照組的基礎(chǔ)上添加1.0％的SBP、RYE、ALF和FOS,經(jīng)38℃厭氧培養(yǎng)24h后,分析培養(yǎng)液中吲哚物質(zhì)和VFA濃度及pH值；采用DGGE和16S rRNA基因序列分析測(cè)定微生物總菌區(qū)系組成。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加SB

8、P和FOS降低培養(yǎng)液中糞臭素濃度和相對(duì)產(chǎn)率,而添加RYE和ALF的作用相反。ALF顯著降低培養(yǎng)液中L-色氨酸的降解率。與對(duì)照組相比,纖維組總VFA和單個(gè)VFA(乙酸、丙酸、丁酸和戊酸)含量顯著增加,pH顯著降低。不同纖維組的DGGE圖譜明顯不同,但也有共同條帶存在。SBP組DGGE圖譜具有較高的多樣性,出現(xiàn)了3條特異條帶,其中2條帶對(duì)應(yīng)的最相似菌分別為Eubacterium rectale和Clostridium sp.。另外,有3條特

9、異條帶出現(xiàn)在SBP、RYE和ALF組中,其中2條帶對(duì)應(yīng)的最相似菌分別為L(zhǎng)achnospira pectinoschiza和Clostridium disporicum。結(jié)果提示,發(fā)酵模式的變化使L-色氨酸的降解率降低及主要降解產(chǎn)物向吲哚轉(zhuǎn)變,這可能是糞臭素濃度降低的因?yàn)?；而?xì)菌Cdisporicum可能與糞臭素的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 第三部分:根據(jù)第二部分的試驗(yàn)結(jié)果選擇兩種對(duì)糞臭素生成有降低作用的纖維源進(jìn)行在體動(dòng)物試驗(yàn),研究纖維源對(duì)

10、豬腸道糞臭素產(chǎn)生、微生態(tài)及肝臟細(xì)胞色素P450基因表達(dá)的影響,包括3個(gè)試驗(yàn)。
　　 試驗(yàn)四研究飼喂肥育豬不同類型纖維后直腸糞臭素濃度和總菌區(qū)系組成的動(dòng)態(tài)性變化。選擇胎次相同、體重相近的杜×長(zhǎng)×大三元雜交去勢(shì)公豬18頭(平均85 kg),隨機(jī)分入對(duì)照組(CON)、甜菜組(SBP)和苜蓿組(ALF),每組6頭。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧,SBP和ALF組各添加20％的甜菜粕和苜蓿,調(diào)整日糧使其等蛋白。在試驗(yàn)第1、8、15、22和29天,每組

11、選擇4頭豬采集直腸糞樣用于吲哚類物質(zhì)、VFA和微生物區(qū)系組成測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),隨著飼喂時(shí)間的延長(zhǎng),SBP和ALF組糞臭素濃度均先上升后降低。與CON相比,第15、22、29天后SBP組糞臭素濃度顯著升高(P＜0.05),而ALF與CON沒有顯著差異。添加纖維對(duì)吲哚濃度無(wú)顯著影響,而日糧因素對(duì)糞臭素濃度有顯著影響(P＜0.05)。第8、15、22和29天SBP組糞樣中總VFA濃度升高,pH值降低(P＜0.05),第22天DGGE圖譜條帶數(shù)和

12、相似性指數(shù)顯著升高(P＜0.05)。對(duì)SBP組第15、22和29天糞樣總菌區(qū)系組成與糞臭素濃度的相關(guān)分析得出,來(lái)自Clostridiales和Lachnospiraceae的細(xì)菌可能與糞臭素的產(chǎn)生有關(guān)。
　　 試驗(yàn)五研究纖維源對(duì)豬不同腸段糞臭素和吲哚濃度的空間變化影響。試驗(yàn)動(dòng)物和日糧同試驗(yàn)四,在試驗(yàn)結(jié)束后第33天,每組選擇4頭屠宰,采集Ce、PC、DC和Re腸道食糜用以糞臭素、吲哚、VFA濃度和微生物區(qū)系測(cè)定。結(jié)果發(fā)現(xiàn),腸段因素

13、對(duì)糞臭素的濃度有顯著影響(P＜0.05),SBP和ALF組盲腸中糞臭素濃度最低。纖維源因素對(duì)糞臭素的濃度沒有顯著影響,但在盲腸SBP和ALF組糞臭素濃度降低。所有試驗(yàn)組總VFA含量從盲腸到直腸穩(wěn)步降低,以SBP組最高。添加SBP能夠增進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。不同日糧的DGGE圖譜相似度較高,SBP組出現(xiàn)特異性的優(yōu)勢(shì)條帶。經(jīng)16S rRNA序列分析表明,結(jié)腸和直腸中亮度較高的2條條帶所對(duì)應(yīng)序列的最相似菌分別為L(zhǎng)actobacill

14、usiohnsoni和Lachnospiraceae,可能在糞臭素的產(chǎn)生中起作用。
　　 試驗(yàn)六研究纖維源對(duì)豬體不同組織、血漿中糞臭素水平和肝臟CYP2E1、CYP2A6基因表達(dá)的影響試驗(yàn)動(dòng)物和日糧同試驗(yàn)四。試驗(yàn)結(jié)束后,每組選擇4頭豬進(jìn)行屠宰,測(cè)定血液生化指標(biāo)、胴體和肉質(zhì)指標(biāo),并采集組織樣品測(cè)定糞臭素和吲哚含量；用Real-time:PCR測(cè)定肝臟CYP2E1和CYP2A6 mRNA表達(dá)豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),豬日糧中添加20％SBP和

15、ALF對(duì)生長(zhǎng)性能沒有顯著影響,顯著降低平均背膘厚(P＜0.05)。添加SBP升高背脂中糞臭素水平,而ALF組趨于降低(P=0.076):SBP和ALF組豬腸脂中糞臭素含量均顯著降低(P＜0.05),背脂、背肌、腹脂和腸脂中吲哚水平也有不同程度的降低。添加SBP顯著提高CYP2E1mRNA表達(dá),而ALF組的CYP2E1和CYP2A6 mRNA表達(dá)都顯著升高(P＜0.05)。SBP和ALF組CYP2E1和CYP2A6酶活均與CON沒有顯著差

16、異。結(jié)果表明,適量添加ALF能夠降低糞臭素水平,調(diào)控效果優(yōu)于SBP,可以應(yīng)用在豬日糧中。ALF降低糞臭素沉積的作用可能與CYP2E1和CYP2A6表達(dá)量的升高有關(guān)。
　　 綜上所述,在達(dá)到性成熟前,豬體糞臭素水平隨著年齡的增長(zhǎng)而升高,與肝臟中CYP2E1和CYP2A6基因的表達(dá)無(wú)確定關(guān)系。豬腸段糞臭素濃度隨著盲腸到直腸的延伸而增加,不同品種及不同腸段微生物區(qū)系組成差別較大,發(fā)酵模式亦不同。不同發(fā)酵類型的纖維物質(zhì)對(duì)豬體糞臭素水平的