白藜三醇抗大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖機制研究.pdf

1、目的：觀察植物雌激素白藜三醇(RV)對大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖的調(diào)控機制，探討ER信號途徑在RV抗動脈粥樣硬化中的重要作用，為今后RV作為血管增殖性疾病新的靶向治療提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：(1)用改良的植塊貼壁法體外培養(yǎng)大鼠血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)，在倒置顯微鏡下進行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察并對培養(yǎng)的細(xì)胞進行SM-α actin免疫組化鑒定。(2)尋找RV對JNK發(fā)揮作用的時間點：培養(yǎng)大鼠VSMCs并用50μmol/l的RV分

2、別干預(yù)0、12、24、36、48、60h，用Western blot檢測各時間點VSMCs中JNK,P-JNK的表達(dá)水平。(3)藥物干預(yù)部分：實驗分為6組(每組n=6)。正常對照組（NC組），含10％胎牛血清(FBS)的DMEM; RV干預(yù)組（RV組），50μmol/L RV干預(yù)24h；血管緊張素Ⅱ組（AngⅡ組），1μ,mol/L AngⅡ干預(yù)12h; RV+AngⅡ組，1μmol/L AngⅡ干預(yù)12h，然后加入50μmol/L R

3、V干預(yù)24h; RV+ICI182780組，1μmol/L ICI182780干預(yù)2h，然后加入50μmol/L RV干預(yù)24h; RV+ICI182780+AngⅡ組，1μmol/L ICI182780干預(yù)2h，然后加入1μmol/L AngⅡ干預(yù)12h，最后加入50μmol/L RV干預(yù)24h。(4)用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖活性(5)使用Western blot檢測各組雌激素受體α(ERα)、雌激素受體β(ERβ)、JNK、P-J

4、NK、P38、P-P38、C-myc蛋白的表達(dá)水平。(6)用RT-PCR檢測如上各干預(yù)組VSMCs中ERβmRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：(1)原代培養(yǎng)的VSMCs生長良好，光鏡下呈長梭形及“峰與谷”樣生長。SMα-actin免疫組化的結(jié)果顯示培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的VSMC特征。(2)RV干預(yù)不同時間各組JNK及P-JNK蛋白的表達(dá)情況：不同時間點各組JNK蛋白的表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。RV干預(yù)12h，24h,36h組

5、P-JNK蛋白較干預(yù)0h組的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），RV干預(yù)48h,60h組較干預(yù)0h組的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。(3)用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖活性顯示各組細(xì)胞增殖活性有明顯差異，RV干預(yù)組細(xì)胞增殖活性最弱，AngⅡ組細(xì)胞增殖活性最強，說明白藜三醇可明顯抑制血管平滑肌細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(4)不同藥物干預(yù)組ERα, ERβ, JNK, P-JNK， P38, P-P38， C-myc蛋白的

6、表達(dá)：各組JNK， P38蛋白表達(dá)差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。ERα, ERβ, P-JNK蛋白的表達(dá)在RV組較其余各組明顯增加，在RV+ICI182780+AngⅡ組較其余各組明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05); P-P38, C-myc蛋白的表達(dá)在AngⅡ組較其余各組明顯增加，在RV組較其余各線明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。(5)各組ERβmRNA的表達(dá)：ERβmRNA的表達(dá)在RV組較其余各組明顯增加，在RV

7、+IC1182780+AngⅡ組較其余各組明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：白藜三醇可促進ERα, ERβ蛋白及ERβmRNA的表達(dá)，且在適宜的濃度和作用時間下，可激活培養(yǎng)的血管平滑肌細(xì)胞JNK信號通路，促進JNK蛋白的磷酸化，白藜三醇的這種作用，可被雌激素受體拮抗劑ICI182780抑制；白藜三醇司以抑制C-myc, P-P38的表達(dá)，該作用也可被ICI182780抑制，說明白藜三醇可能是通過與血管平滑肌細(xì)