人間充質(zhì)干細(xì)胞治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的可行性研究.pdf

1、目的：通過建立標(biāo)準(zhǔn)的大鼠類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型,觀察間充質(zhì)干細(xì)胞在CIA模型中的免疫調(diào)節(jié)與組織修復(fù)功能。
　　對象與方法：1.SPF級體重160±20g左右wistar雄性大鼠,按照文獻(xiàn)報(bào)道方法建立標(biāo)準(zhǔn)的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎模型。2.利用MSC體外貼壁生長的特性,體外培養(yǎng)人骨髓/臍帶MSC,獲得較純的MSC,通過分析細(xì)胞的表型及體外成脂肪和成骨能力,進(jìn)行MSC鑒定。3.實(shí)驗(yàn)分兩部分,第一,將大鼠分四組,預(yù)防組免疫次日及第8日腹腔注射骨髓MS

2、C,治療組從第三周開始每周一次腹腔注射骨髓MSC,細(xì)胞數(shù)均為1×107細(xì)胞/每只大鼠,對照組注射等量生理鹽水直至免疫結(jié)束。第二,觀察TNF-alpha處理MSC后,細(xì)胞內(nèi)NF-kappaB核轉(zhuǎn)移情況,以及TNF-alpha處理對細(xì)胞增殖和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)的影響。之后,將實(shí)驗(yàn)大鼠分四組,免疫次日,A組腹腔注射臍帶MSC,B組腹腔注射經(jīng)TNF-alpha(50ng/ml)處理48小時(shí)后的臍帶MSC,1×107細(xì)胞/每只,共四周,對照組等量生

3、理鹽水。治療結(jié)束后處死全部大鼠,膝關(guān)節(jié)病理切片及評分判定細(xì)胞治療效果。4.數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPASS13.0軟件,采用t檢驗(yàn)、單元方差分析及等級資料秩和檢驗(yàn)方法,對資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,p<0.05為顯著差異。
　　結(jié)果：1.動(dòng)物模型的建立:CIA模型組首次免疫注射后,皮內(nèi)注射部位及尾根部有多處小潰瘍、結(jié)節(jié),大約1周左右大鼠踝關(guān)節(jié)即開始出現(xiàn)紅腫,潰瘍結(jié)痂愈合。第14天趾關(guān)節(jié)全部出現(xiàn)紅腫,且踝關(guān)節(jié)開始受累,第21天達(dá)高峰,

4、之后腫脹趨于穩(wěn)定。在第28天逐漸出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形。自免疫后,模型組動(dòng)物體重增長較正常大鼠明顯緩慢,在第27天有一過性體重下降現(xiàn)象.免疫結(jié)束后處死實(shí)驗(yàn)組大鼠,膝關(guān)節(jié)病理可見滑膜增生、新生血管和炎細(xì)胞浸潤現(xiàn)象,病變可侵蝕至軟骨和骨,主要表現(xiàn)為廣泛的炎性細(xì)胞浸潤和關(guān)節(jié)腔粘連,符合類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎標(biāo)準(zhǔn)。2.人骨髓及臍帶MSC的培養(yǎng)及鑒定:骨髓單個(gè)核細(xì)胞或臍帶消化細(xì)胞接種24小時(shí)后,可以見到少量成纖維樣細(xì)胞貼壁生長、分散存在,培養(yǎng)6天后可見成纖維樣細(xì)胞

5、集落出現(xiàn)。流式檢測結(jié)果分析:MSC高表達(dá)CD44和CD73,不表達(dá)CD31,CD34和CD45。體外成骨誘導(dǎo)2周后,細(xì)胞堿性磷酸酶陽性。在成脂體系中培養(yǎng)第2周,進(jìn)行油紅O染色,鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)脂肪小滴形成情況。結(jié)果表明培養(yǎng)的細(xì)胞符合MSC標(biāo)準(zhǔn)。3.第一部分結(jié)果表明,所有實(shí)驗(yàn)組大鼠都出現(xiàn)了關(guān)節(jié)炎癥狀,而且在后期出現(xiàn)了關(guān)節(jié)畸形。細(xì)胞預(yù)防組與治療組關(guān)節(jié)炎評分顯著均高于對照組(p<0.01),6周時(shí)分別為9.5±0.5,9.4±0.6和7.6±0

6、.6,預(yù)防組和治療組之間無差異。病理學(xué)分析顯示,MSC預(yù)防與治療組膝關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)炎評分均高于模型組。此外,預(yù)防組、MSC治療組和對照組大鼠脾臟有核細(xì)胞中,CD86+百分比分別為4.16±1.48,4.06±1.97,4.15±2.04,各組CD11b/c+CD86+百分比分別為1.04±0.68,0.95±0.56,0.98±0.44,三組沒有顯著差異,但均高于健康大鼠(0.97±0.18和0.30±0.17,p均小于0.05)。第

7、二部分結(jié)果表明,TNF-α處理后,NF-kappa B迅速從胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核,但這種作用不影響MSC體外增殖。在不同細(xì)胞濃度條件下,無論TNF-α處理與否,MSC均可顯著抑制淋巴細(xì)胞增殖(p值均小于0.0001);TNF-α處理的MSC有更強(qiáng)的抑制作用,在低細(xì)胞濃度條件下尤為顯著。然而,病理分析顯示,細(xì)胞治療組關(guān)節(jié)炎性浸潤顯著加重,病理評分明顯高于未治療組(p<0.05)。
　　結(jié)論：1.利用多點(diǎn)注射牛II型膠原和弗氏完全/不完