羅哌卡因?qū)Υ笫蠹顾璐┐虛p傷后脊髓神經(jīng)毒性的影響.pdf

1、椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯是臨床上常采用的麻醉方法,能保持患者清醒,麻醉恢復(fù)平穩(wěn),易于術(shù)后鎮(zhèn)痛,節(jié)省醫(yī)療費(fèi)用。但自1991年來陸續(xù)出現(xiàn)關(guān)于局麻藥椎管內(nèi)麻醉后發(fā)生神經(jīng)并發(fā)癥的報(bào)道。
　　 近年來多種研究(前瞻性、回顧性、流行病學(xué)、薈萃分析等)發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯后出現(xiàn)神經(jīng)并發(fā)癥的發(fā)生率為1/1000～1/1,000,000。Rigler等人于1991年報(bào)道了四例病人連續(xù)椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯后出現(xiàn)馬尾神經(jīng)綜合癥(canda equinasyndrome

2、,CES),由此對椎管內(nèi)應(yīng)用局部麻醉藥的安全性產(chǎn)生質(zhì)疑。兩年后,Schneider等于1993年發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)應(yīng)用5％的利多卡因發(fā)生了一過性神經(jīng)綜合癥(transient radicular irritation,TNS)。大量臨床研究的結(jié)果提示:椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯并發(fā)癥高于硬膜外阻滯,其中TNS的發(fā)生率高于CES,而且使用利多卡因較布比卡因出現(xiàn)兩者的幾率高。
　　 臨床上,CES表現(xiàn)為會陰區(qū)的麻木感和感覺減退,還有大小便功能的失常,并

3、伴有下肢運(yùn)動功能的障礙；而TNS的疼痛癥狀表現(xiàn)為從臀部開始向兩下肢放射,疼痛的強(qiáng)度有輕有重,可伴有下肢無力、麻木、感覺異?；蚰蜾罅舻?。TNS一般在5天內(nèi)可自行恢復(fù),而CES神經(jīng)功能恢復(fù)時(shí)間長或有可能導(dǎo)致永久性的神經(jīng)功能障礙。總體來說,出現(xiàn)神經(jīng)并發(fā)癥的患者當(dāng)中有85％的患者的神經(jīng)功能可在三個(gè)月內(nèi)恢復(fù)正常。引起這些并發(fā)癥的原因有局麻藥、直接穿刺或留置導(dǎo)管對神經(jīng)的損傷、脊髓缺血、感染等。其中最重要原因有脊髓直接穿刺損傷和局麻藥物毒性。

4、　　 大量的研究表明脊髓損傷可引起局部炎性細(xì)胞因子釋放,同時(shí)出現(xiàn)了神經(jīng)功能障礙。為了減少穿刺帶來的脊髓直接損傷,自1841年以來,歷史上眾多學(xué)者對腰穿刺針已經(jīng)進(jìn)行了多達(dá)24次的研發(fā),分別從針尖形狀及針直徑大小改進(jìn)。包括早期的切割式針尖到現(xiàn)在的筆尖式針尖,大小也從13G縮小到現(xiàn)在25G、27G甚至29G。但臨床上神經(jīng)穿刺損傷情況仍然不能完全避免。目前對局麻藥引起神經(jīng)組織的超微結(jié)構(gòu)、代謝以及電生理改變成為減少神經(jīng)并發(fā)癥的研究重點(diǎn)。局麻藥對

5、脊髓神經(jīng)細(xì)胞毒性的研究不但有臨床觀察、動物實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞水平探討,也有細(xì)胞內(nèi)線粒體、鈣離子及分子水平的研究。但脊髓穿刺損傷后局麻藥注射對脊髓組織功能的影響目前還少見報(bào)道。
　　 為此,本研究擬從動物整體水平,建立脊髓針刺損傷動物模型,通過觀察脊髓組織損傷后炎性細(xì)胞因子變化及局麻藥注射后對脊髓組織炎性細(xì)胞因子的影響,探討局麻藥神經(jīng)毒性與炎性細(xì)胞因子的可能關(guān)系,為臨床防治針刺損傷后局麻藥注射的神經(jīng)毒性提供理論依據(jù)。
　　 第一章

6、大鼠脊髓針刺損傷動物模型的建立與評價(jià)
　　 目的：
　　 研究局麻藥的脊髓毒性作用機(jī)制,需建立理想的大鼠脊髓針刺損傷動物模型。本研究通過觀察損傷后病理生理、運(yùn)動及電生理改變,模擬臨床情況,尋找對脊髓損傷程度最小的方法,為研究局麻藥脊髓毒性提供可信的動物模型。
　　 方法：
　　 健康SD大鼠144只,體重150g～200g,雌雄不分。隨機(jī)分為對照組(假手術(shù)組,n=36)和實(shí)驗(yàn)組(n=108)。實(shí)驗(yàn)組按脊髓

7、損傷(spinal cord injury,SCI)程度分為A組(29G,n=36),B組(25G,n=36),C組(21G,n=36)。健康SD大鼠稱重并記錄。麻醉誘導(dǎo):吸入3％七氟醚；麻醉維持:吸入2％七氟醚。大鼠取俯臥位,背部去毛后常規(guī)消毒,后沿背部正中線切開皮膚。分離脊柱兩側(cè)肌肉,充分暴露脊柱棘突兩側(cè),找到L5橫突及椎間孔。確定位置后,用細(xì)咬骨鉗咬除L4棘突,暴露L4-5節(jié)段問的硬脊膜。直視下分別用21G、25G、29G帶斜面的

8、針以與脊柱尾端成60°角沿神經(jīng)脊髓正中向頭部刺入L4-5節(jié)段脊髓,以大鼠出現(xiàn)尾動為有效穿刺損傷,停留2秒后拔出針頭,依層分別縫合肌肉、皮下筋膜及皮膚。記錄手術(shù)操作時(shí)間。術(shù)畢肌注青霉素鈉4萬單位,術(shù)中臺燈照射保溫。大鼠分組飼養(yǎng),每日檢查傷口有無感染。假手術(shù)組除不穿刺損傷脊髓以外,其余同實(shí)驗(yàn)組。術(shù)后常規(guī)人工排尿2～3次,直至膀胱恢復(fù)自主排尿。大鼠檢測點(diǎn):每組分別在術(shù)前進(jìn)行雙后肢運(yùn)動功能評分,然后進(jìn)行術(shù)后8h、24h、72h、1w、2w時(shí)點(diǎn)檢

9、測電生理,每時(shí)點(diǎn)6只大鼠,檢測結(jié)束后處死大鼠,取相應(yīng)節(jié)段脊髓進(jìn)行HE染色進(jìn)行病理觀察。各組大鼠分別在術(shù)后8h、24h、72h、1w、2w進(jìn)行運(yùn)動功能評分(BBB評分),檢測運(yùn)動誘發(fā)電位(motor voked potentials,MEP)和觀測組織切片。本研究各組SD大鼠數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,組問比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,組間多重比較采用LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)

10、意義。
　　 結(jié)果：
　　 本實(shí)驗(yàn)暴露脊髓手術(shù)操作時(shí)出血約0.2ml～0.3ml,給予腹腔注射生理鹽水0.4ml～0.6ml補(bǔ)充血容量。穿刺損傷脊髓后,由于穿刺針的大小不同,各組脊髓局部充血程度不同。整個(gè)實(shí)驗(yàn)中C組有1只因麻醉過深呼吸抑制缺氧死亡,死亡率為2.8％；A組和B組無死亡。術(shù)后8h,所有大鼠均完全清醒。C組各時(shí)點(diǎn)與對照組相比BBB評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05),隨著時(shí)間的延長,BBB評分有所恢復(fù)。術(shù)后24h,

11、B組與對照組相比BBB評分72h以內(nèi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。C組BBB評分與對照組各時(shí)點(diǎn)相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,A組損傷后恢復(fù)最快,8h后與對照組BBB評分無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；B組次之,72h時(shí)BBB評分為(19.5±0.5),1w后完全恢復(fù)；C組損傷最重,運(yùn)動恢復(fù)最差,1w時(shí)BBB評分(16.7±1.4),到2w時(shí)也未完全恢復(fù)正常。C組在2w后部軀體出現(xiàn)輕度萎縮,并且由于長期觸地、摩擦,尿道口伴輕度糜爛。術(shù)后各實(shí)驗(yàn)組MEP峰

12、潛伏期72h后與對照級相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。8h時(shí),A組MEP峰潛伏期與對照組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),但B組、C組24h時(shí)MEP峰潛伏期與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)各組間MEP峰潛伏期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。C組與B組MEP峰潛伏期在損傷后72h后與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。脊髓組織病理改變實(shí)驗(yàn)組可見充血、水腫改變,主要位于脊髓穿刺周圍。實(shí)驗(yàn)組8h時(shí)可見脊髓損傷周圍充血水腫。A組

13、損傷早期出血、水腫,至24h時(shí)可見充血、水腫緩解。術(shù)后72h水腫消退,可見淋巴細(xì)胞浸潤,毛細(xì)血管增生,可見到神經(jīng)元衛(wèi)星現(xiàn)象,至第1w時(shí)增生的炎性細(xì)胞和毛細(xì)血管逐漸恢復(fù)正常。A組各時(shí)點(diǎn)無神經(jīng)元固縮壞死。
　　 結(jié)論：
　　 本實(shí)驗(yàn)通過行為學(xué)、神經(jīng)電生理及病理學(xué)評估,以大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物,仿照人類椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯真實(shí)過程的方法,應(yīng)用29G穿刺針建立大鼠脊髓針刺損傷動物模型,具有針刺精確、損傷小、重復(fù)性好的特點(diǎn),為將局麻藥脊髓直接

14、注射后研究局麻藥毒性機(jī)制提供了可信的動物模型。
　　 第二章脊髓針刺損傷后羅哌卡因?qū)顾柩仔约?xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的影響
　　 目的：
　　 通過研究羅哌卡因脊髓內(nèi)注射后細(xì)胞因子變化探討羅哌卡因的脊髓毒性的可能作用機(jī)制及判斷脊髓毒性的預(yù)后。
　　 方法：
　　 SD大鼠144只隨機(jī)分為對照組(n=36)和實(shí)驗(yàn)組(n=108)。對照組:暴露脊髓硬膜后只用29G針頭行脊髓

15、穿刺損傷,不作注射(n=36)；NS組(A組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷并脊髓內(nèi)注射生理鹽水4μl(n=36)；0.5％羅哌卡因組(B組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷并脊髓內(nèi)注射0.5％羅哌卡因4μl(n=36)；2％羅哌卡因組(C組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷并脊髓內(nèi)注射2％羅哌卡因4μl(n=36)。脊髓針刺損傷模型制備,同第一章。采用過氧化物酶標(biāo)記的鏈菌素親生物素復(fù)合物(SABC)法對8h、

16、24h、72h、1w、2w各時(shí)點(diǎn)脊髓組織4種細(xì)胞因子進(jìn)行檢測；實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測脊髓組織4種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)。檢測步驟:①無菌收集大鼠脊髓組織；②提取脊髓組織總RNA。③逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),在逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的作用下,將mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA分子。④定量PCR反應(yīng)。⑤根據(jù)FTC-2000軟件分析數(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。⑥根據(jù)公式計(jì)算出待測基因相對定量值。免疫印跡(Western blotting)檢測脊髓組織4種細(xì)胞因子蛋白的相對表達(dá),檢

17、測步驟:脊髓組織總蛋白的提取,蛋白質(zhì)濃度測定,SDS-PAGE膠電泳,轉(zhuǎn)膜,免疫檢測,蛋白條帶灰度用Kodaka Digital密度掃描儀掃描分析。本研究各組SD大鼠數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,組問多重比較采用LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 (1)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),對照組和A組,IL-1β、IL-6、IL

18、—10和TNF-α蛋白的表達(dá)主要在炎性浸潤細(xì)胞漿。B組和C組大鼠脊髓損傷后8h、24h、72h、1w、2w各時(shí)點(diǎn)IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的均有陽性表達(dá),但隨時(shí)間延長,陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)逐漸減少；與對照組相比,B組和C組大鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表達(dá)增加有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.05。脊髓損傷后2w,B組與C組IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表達(dá)陽性數(shù)減少,與對照組相比

19、較沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；與對照組相比,A組大鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表達(dá)略有增加,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P>0.05。
　　 (2)免疫印跡檢測脊髓組織對照組與0.5％羅哌卡因組的4種細(xì)胞因子蛋白的相對表達(dá)結(jié)果。羅哌卡因脊髓內(nèi)注射后第8h,0.5％羅哌卡因組大鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白表達(dá)水平(分別為16.38±1.83,14.65±2.28,19.09±1.

20、68和21.67±2.43)均高于對照組(分別為4.53±0.47,3.89±0.43,4.77±0.39和5.31±0.38,P<0.01)
　　 結(jié)論：
　　 脊髓穿刺損傷后注射羅哌卡因可引起脊髓組織釋放細(xì)胞因子增加,且與羅哌卡因濃度有關(guān)。但單次的羅哌卡因注射對脊髓組織釋放的細(xì)胞因子的影響時(shí)間短。羅哌卡因可能通過增加IL-1β、IL-6及TNF-α細(xì)胞因子加重了脊髓損傷后對脊髓組織的毒性作用,而IL-10的增加對其他

21、促炎因子有抑制作用。因此,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α可能是脊髓損傷后的重要免疫標(biāo)志物。提示臨床上羅哌卡因注射到損傷的脊髓組織可加重局部炎癥或可引起神經(jīng)功能異常,因此必要時(shí)檢測腦積液IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α,有助于脊髓損傷的及時(shí)診斷、病情程度判斷同時(shí)也為合理治療羅哌卡因脊髓注射損傷提供理論依據(jù)。
　　 第三章脊髓損傷后羅哌卡因?qū)顾桎\指蛋白A20表達(dá)的影響
　　 目的：

22、
　　 本實(shí)驗(yàn)旨在通過研究羅哌卡因脊髓內(nèi)注射損傷后,脊髓組織內(nèi)鋅脂蛋白A20的表達(dá)變化規(guī)律,探討羅哌卡因與神經(jīng)元繼發(fā)性損害的相互關(guān)系。
　　 方法：
　　 SD大鼠159只,體重150g～200g,雌雄不分。實(shí)驗(yàn)前12h禁食,可自由飲水。對照組:暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷,不作任何注射(n=36)；生理鹽水組(A組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓內(nèi)注射生理鹽水4μl(n=41)；0.5％羅哌卡因組

23、(B組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓內(nèi)注射0.5％羅哌卡因4μl(n=41)；2％羅哌卡因組(C組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓內(nèi)注射2％羅哌卡因4μl(n=41)。脊髓損傷針刺模型制備,同第二章。術(shù)中臺燈照射保溫,術(shù)畢肌注青霉素鈉4萬單位。大鼠分組飼養(yǎng),每日檢查有無局部感染。術(shù)后常規(guī)人工排尿2～3次,直至恢復(fù)自主膀胱。各組于術(shù)后8h、24h、72h、1w、2w時(shí)間點(diǎn),各時(shí)點(diǎn)6只大鼠,行BBB評分、TFL和病理組織學(xué)觀察。BBB

24、評分,同第一章。用TFL檢測儀測TFL。病理組織學(xué)觀察:吸入3％七氟醚麻醉后,左心室插管,剪開右心耳,先用50ml生理鹽水灌洗,再用40％甲醛50ml灌注,以穿刺損傷點(diǎn)為中心切取約10mm的脊髓,中性福爾馬林固定48～72h,取穿刺部位,常規(guī)石蠟包埋,組織切片,HE染色。蛋白的免疫組化檢測:切片標(biāo)本采用S-P免疫組化染色試劑盒(三鷹生物技術(shù)有限公司),根據(jù)說明書進(jìn)行染色。一抗A20單克隆抗體(大鼠來源IG1,美國ACTIVEMOTIF公

25、司)濃度為1:300,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。選取各組各時(shí)相點(diǎn)的切片染色,每時(shí)間點(diǎn)6只動物,每只動物隨機(jī)取出3個(gè)層面,經(jīng)與本實(shí)驗(yàn)不相關(guān)的2位工作人員光鏡下計(jì)數(shù)每個(gè)層面陽性細(xì)胞數(shù),取平均數(shù)即為每個(gè)標(biāo)本平均陽性細(xì)胞數(shù),并對各時(shí)間點(diǎn)6只動物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。本研究各組SD大鼠數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示,運(yùn)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析,組間比較采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析,組間多重比較采用LSD法

26、。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 所有大鼠無死亡,各組大鼠活動進(jìn)食等無明顯改變,實(shí)驗(yàn)A組、B組和C組大鼠當(dāng)天進(jìn)食少,精神欠佳；所有大鼠無后肢癱瘓和排尿困難。術(shù)后8h,所有大鼠都完全清醒。B組(0.5％羅哌卡因)、C組(2％羅哌卡因)與對照組比較72h前的BBB評分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。A組(0.9％NS)與對照組比較所有時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2w各組大鼠脊髓運(yùn)動功能均可恢復(fù)。HE染色:在脊髓穿刺

27、損傷部位可見充血與水腫,以8h最明顯,24h后逐步恢復(fù)。72h可見淋巴細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目增加。1w時(shí)淋巴細(xì)胞數(shù)目逐步正常。2％羅哌卡因組可見少量的神經(jīng)細(xì)胞壞死,但0.5％羅哌卡因組沒有發(fā)現(xiàn)壞死的神經(jīng)細(xì)胞。TFL的比較:術(shù)后8h,實(shí)驗(yàn)組與對照組間TFL比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。術(shù)后72h,0.5％羅哌卡因組和2％羅哌卡因組與對照組相比TFL延長,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。A組與對照組相比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。免疫組化染色結(jié)果:對照組各時(shí)間點(diǎn)脊髓

28、組織可見少量神經(jīng)元細(xì)胞胞質(zhì)鋅指蛋白A20陽性表達(dá),實(shí)驗(yàn)組中A組、B組、C組三組均在術(shù)后8h可見A20表達(dá)陽性,鋅指蛋白A20陽性表達(dá)程度:C組>B組>A組,三組至24h時(shí)A20陽性表達(dá)達(dá)到高峰值,各組1w時(shí)陽性表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)論：
　　 鋅指蛋白A20是機(jī)體的一種重要的內(nèi)源性抗炎因子,具有保護(hù)效應(yīng)。羅哌卡因可誘發(fā)A20-過性高表達(dá),對調(diào)控羅哌卡因作用于脊髓損傷后脊髓組織的炎癥反應(yīng)引發(fā)的繼發(fā)性損傷具有重要保護(hù)意