羅哌卡因對大鼠脊髓穿刺損傷后脊髓神經(jīng)毒性的影響.pdf

1、椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯是臨床上常采用的麻醉方法,能保持患者清醒,麻醉恢復平穩(wěn),易于術后鎮(zhèn)痛,節(jié)省醫(yī)療費用。但自1991年來陸續(xù)出現(xiàn)關于局麻藥椎管內(nèi)麻醉后發(fā)生神經(jīng)并發(fā)癥的報道。
　　 近年來多種研究(前瞻性、回顧性、流行病學、薈萃分析等)發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯后出現(xiàn)神經(jīng)并發(fā)癥的發(fā)生率為1/1000～1/1,000,000。Rigler等人于1991年報道了四例病人連續(xù)椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯后出現(xiàn)馬尾神經(jīng)綜合癥(canda equinasyndrome

2、,CES),由此對椎管內(nèi)應用局部麻醉藥的安全性產(chǎn)生質疑。兩年后,Schneider等于1993年發(fā)現(xiàn)椎管內(nèi)應用5％的利多卡因發(fā)生了一過性神經(jīng)綜合癥(transient radicular irritation,TNS)。大量臨床研究的結果提示:椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯并發(fā)癥高于硬膜外阻滯,其中TNS的發(fā)生率高于CES,而且使用利多卡因較布比卡因出現(xiàn)兩者的幾率高。
　　 臨床上,CES表現(xiàn)為會陰區(qū)的麻木感和感覺減退,還有大小便功能的失常,并

3、伴有下肢運動功能的障礙；而TNS的疼痛癥狀表現(xiàn)為從臀部開始向兩下肢放射,疼痛的強度有輕有重,可伴有下肢無力、麻木、感覺異?；蚰蜾罅舻?。TNS一般在5天內(nèi)可自行恢復,而CES神經(jīng)功能恢復時間長或有可能導致永久性的神經(jīng)功能障礙?？傮w來說,出現(xiàn)神經(jīng)并發(fā)癥的患者當中有85％的患者的神經(jīng)功能可在三個月內(nèi)恢復正常。引起這些并發(fā)癥的原因有局麻藥、直接穿刺或留置導管對神經(jīng)的損傷、脊髓缺血、感染等。其中最重要原因有脊髓直接穿刺損傷和局麻藥物毒性。

4、　　 大量的研究表明脊髓損傷可引起局部炎性細胞因子釋放,同時出現(xiàn)了神經(jīng)功能障礙。為了減少穿刺帶來的脊髓直接損傷,自1841年以來,歷史上眾多學者對腰穿刺針已經(jīng)進行了多達24次的研發(fā),分別從針尖形狀及針直徑大小改進。包括早期的切割式針尖到現(xiàn)在的筆尖式針尖,大小也從13G縮小到現(xiàn)在25G、27G甚至29G。但臨床上神經(jīng)穿刺損傷情況仍然不能完全避免。目前對局麻藥引起神經(jīng)組織的超微結構、代謝以及電生理改變成為減少神經(jīng)并發(fā)癥的研究重點。局麻藥對

5、脊髓神經(jīng)細胞毒性的研究不但有臨床觀察、動物實驗、細胞水平探討,也有細胞內(nèi)線粒體、鈣離子及分子水平的研究。但脊髓穿刺損傷后局麻藥注射對脊髓組織功能的影響目前還少見報道。
　　 為此,本研究擬從動物整體水平,建立脊髓針刺損傷動物模型,通過觀察脊髓組織損傷后炎性細胞因子變化及局麻藥注射后對脊髓組織炎性細胞因子的影響,探討局麻藥神經(jīng)毒性與炎性細胞因子的可能關系,為臨床防治針刺損傷后局麻藥注射的神經(jīng)毒性提供理論依據(jù)。
　　 第一章

6、大鼠脊髓針刺損傷動物模型的建立與評價
　　 目的：
　　 研究局麻藥的脊髓毒性作用機制,需建立理想的大鼠脊髓針刺損傷動物模型。本研究通過觀察損傷后病理生理、運動及電生理改變,模擬臨床情況,尋找對脊髓損傷程度最小的方法,為研究局麻藥脊髓毒性提供可信的動物模型。
　　 方法：
　　 健康SD大鼠144只,體重150g～200g,雌雄不分。隨機分為對照組(假手術組,n=36)和實驗組(n=108)。實驗組按脊髓

7、損傷(spinal cord injury,SCI)程度分為A組(29G,n=36),B組(25G,n=36),C組(21G,n=36)。健康SD大鼠稱重并記錄。麻醉誘導:吸入3％七氟醚；麻醉維持:吸入2％七氟醚。大鼠取俯臥位,背部去毛后常規(guī)消毒,后沿背部正中線切開皮膚。分離脊柱兩側肌肉,充分暴露脊柱棘突兩側,找到L5橫突及椎間孔。確定位置后,用細咬骨鉗咬除L4棘突,暴露L4-5節(jié)段問的硬脊膜。直視下分別用21G、25G、29G帶斜面的

8、針以與脊柱尾端成60°角沿神經(jīng)脊髓正中向頭部刺入L4-5節(jié)段脊髓,以大鼠出現(xiàn)尾動為有效穿刺損傷,停留2秒后拔出針頭,依層分別縫合肌肉、皮下筋膜及皮膚。記錄手術操作時間。術畢肌注青霉素鈉4萬單位,術中臺燈照射保溫。大鼠分組飼養(yǎng),每日檢查傷口有無感染。假手術組除不穿刺損傷脊髓以外,其余同實驗組。術后常規(guī)人工排尿2～3次,直至膀胱恢復自主排尿。大鼠檢測點:每組分別在術前進行雙后肢運動功能評分,然后進行術后8h、24h、72h、1w、2w時點檢

9、測電生理,每時點6只大鼠,檢測結束后處死大鼠,取相應節(jié)段脊髓進行HE染色進行病理觀察。各組大鼠分別在術后8h、24h、72h、1w、2w進行運動功能評分(BBB評分),檢測運動誘發(fā)電位(motor voked potentials,MEP)和觀測組織切片。本研究各組SD大鼠數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,組問比較采用完全隨機設計資料的方差分析,組間多重比較采用LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計學

10、意義。
　　 結果：
　　 本實驗暴露脊髓手術操作時出血約0.2ml～0.3ml,給予腹腔注射生理鹽水0.4ml～0.6ml補充血容量。穿刺損傷脊髓后,由于穿刺針的大小不同,各組脊髓局部充血程度不同。整個實驗中C組有1只因麻醉過深呼吸抑制缺氧死亡,死亡率為2.8％；A組和B組無死亡。術后8h,所有大鼠均完全清醒。C組各時點與對照組相比BBB評分有統(tǒng)計學差異(P<0.05),隨著時間的延長,BBB評分有所恢復。術后24h,

11、B組與對照組相比BBB評分72h以內(nèi)有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。C組BBB評分與對照組各時點相比無統(tǒng)計學差異,A組損傷后恢復最快,8h后與對照組BBB評分無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；B組次之,72h時BBB評分為(19.5±0.5),1w后完全恢復；C組損傷最重,運動恢復最差,1w時BBB評分(16.7±1.4),到2w時也未完全恢復正常。C組在2w后部軀體出現(xiàn)輕度萎縮,并且由于長期觸地、摩擦,尿道口伴輕度糜爛。術后各實驗組MEP峰

12、潛伏期72h后與對照級相比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。8h時,A組MEP峰潛伏期與對照組無統(tǒng)計學差異(P>0.05),但B組、C組24h時MEP峰潛伏期與對照組相比有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。實驗各組間MEP峰潛伏期有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。C組與B組MEP峰潛伏期在損傷后72h后與對照組相比無統(tǒng)計學差異(P<0.05)。脊髓組織病理改變實驗組可見充血、水腫改變,主要位于脊髓穿刺周圍。實驗組8h時可見脊髓損傷周圍充血水腫。A組

13、損傷早期出血、水腫,至24h時可見充血、水腫緩解。術后72h水腫消退,可見淋巴細胞浸潤,毛細血管增生,可見到神經(jīng)元衛(wèi)星現(xiàn)象,至第1w時增生的炎性細胞和毛細血管逐漸恢復正常。A組各時點無神經(jīng)元固縮壞死。
　　 結論：
　　 本實驗通過行為學、神經(jīng)電生理及病理學評估,以大鼠作為實驗動物,仿照人類椎管內(nèi)神經(jīng)阻滯真實過程的方法,應用29G穿刺針建立大鼠脊髓針刺損傷動物模型,具有針刺精確、損傷小、重復性好的特點,為將局麻藥脊髓直接

14、注射后研究局麻藥毒性機制提供了可信的動物模型。
　　 第二章脊髓針刺損傷后羅哌卡因對脊髓炎性細胞因子IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α的影響
　　 目的：
　　 通過研究羅哌卡因脊髓內(nèi)注射后細胞因子變化探討羅哌卡因的脊髓毒性的可能作用機制及判斷脊髓毒性的預后。
　　 方法：
　　 SD大鼠144只隨機分為對照組(n=36)和實驗組(n=108)。對照組:暴露脊髓硬膜后只用29G針頭行脊髓

15、穿刺損傷,不作注射(n=36)；NS組(A組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷并脊髓內(nèi)注射生理鹽水4μl(n=36)；0.5％羅哌卡因組(B組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷并脊髓內(nèi)注射0.5％羅哌卡因4μl(n=36)；2％羅哌卡因組(C組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷并脊髓內(nèi)注射2％羅哌卡因4μl(n=36)。脊髓針刺損傷模型制備,同第一章。采用過氧化物酶標記的鏈菌素親生物素復合物(SABC)法對8h、

16、24h、72h、1w、2w各時點脊髓組織4種細胞因子進行檢測；實時熒光定量PCR法檢測脊髓組織4種細胞因子的mRNA表達。檢測步驟:①無菌收集大鼠脊髓組織；②提取脊髓組織總RNA。③逆轉錄反應,在逆轉錄酶M-MLV的作用下,將mRNA轉錄成cDNA分子。④定量PCR反應。⑤根據(jù)FTC-2000軟件分析數(shù)建立標準曲線。⑥根據(jù)公式計算出待測基因相對定量值。免疫印跡(Western blotting)檢測脊髓組織4種細胞因子蛋白的相對表達,檢

17、測步驟:脊髓組織總蛋白的提取,蛋白質濃度測定,SDS-PAGE膠電泳,轉膜,免疫檢測,蛋白條帶灰度用Kodaka Digital密度掃描儀掃描分析。本研究各組SD大鼠數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析,組問多重比較采用LSD法。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 (1)免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),對照組和A組,IL-1β、IL-6、IL

18、—10和TNF-α蛋白的表達主要在炎性浸潤細胞漿。B組和C組大鼠脊髓損傷后8h、24h、72h、1w、2w各時點IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的均有陽性表達,但隨時間延長,陽性表達細胞數(shù)逐漸減少；與對照組相比,B組和C組大鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表達增加有統(tǒng)計學差異,P<0.05。脊髓損傷后2w,B組與C組IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表達陽性數(shù)減少,與對照組相比

19、較沒有統(tǒng)計學差異(P>0.05)；與對照組相比,A組大鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白的表達略有增加,無統(tǒng)計學差異,P>0.05。
　　 (2)免疫印跡檢測脊髓組織對照組與0.5％羅哌卡因組的4種細胞因子蛋白的相對表達結果。羅哌卡因脊髓內(nèi)注射后第8h,0.5％羅哌卡因組大鼠脊髓組織IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α蛋白表達水平(分別為16.38±1.83,14.65±2.28,19.09±1.

20、68和21.67±2.43)均高于對照組(分別為4.53±0.47,3.89±0.43,4.77±0.39和5.31±0.38,P<0.01)
　　 結論：
　　 脊髓穿刺損傷后注射羅哌卡因可引起脊髓組織釋放細胞因子增加,且與羅哌卡因濃度有關。但單次的羅哌卡因注射對脊髓組織釋放的細胞因子的影響時間短。羅哌卡因可能通過增加IL-1β、IL-6及TNF-α細胞因子加重了脊髓損傷后對脊髓組織的毒性作用,而IL-10的增加對其他

21、促炎因子有抑制作用。因此,本實驗結果表明,IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α可能是脊髓損傷后的重要免疫標志物。提示臨床上羅哌卡因注射到損傷的脊髓組織可加重局部炎癥或可引起神經(jīng)功能異常,因此必要時檢測腦積液IL-1β、IL-6、IL-10和TNF-α,有助于脊髓損傷的及時診斷、病情程度判斷同時也為合理治療羅哌卡因脊髓注射損傷提供理論依據(jù)。
　　 第三章脊髓損傷后羅哌卡因對脊髓鋅指蛋白A20表達的影響
　　 目的：

22、
　　 本實驗旨在通過研究羅哌卡因脊髓內(nèi)注射損傷后,脊髓組織內(nèi)鋅脂蛋白A20的表達變化規(guī)律,探討羅哌卡因與神經(jīng)元繼發(fā)性損害的相互關系。
　　 方法：
　　 SD大鼠159只,體重150g～200g,雌雄不分。實驗前12h禁食,可自由飲水。對照組:暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓穿刺損傷,不作任何注射(n=36)；生理鹽水組(A組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓內(nèi)注射生理鹽水4μl(n=41)；0.5％羅哌卡因組

23、(B組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓內(nèi)注射0.5％羅哌卡因4μl(n=41)；2％羅哌卡因組(C組)暴露脊髓硬膜后用29G針頭行脊髓內(nèi)注射2％羅哌卡因4μl(n=41)。脊髓損傷針刺模型制備,同第二章。術中臺燈照射保溫,術畢肌注青霉素鈉4萬單位。大鼠分組飼養(yǎng),每日檢查有無局部感染。術后常規(guī)人工排尿2～3次,直至恢復自主膀胱。各組于術后8h、24h、72h、1w、2w時間點,各時點6只大鼠,行BBB評分、TFL和病理組織學觀察。BBB

24、評分,同第一章。用TFL檢測儀測TFL。病理組織學觀察:吸入3％七氟醚麻醉后,左心室插管,剪開右心耳,先用50ml生理鹽水灌洗,再用40％甲醛50ml灌注,以穿刺損傷點為中心切取約10mm的脊髓,中性福爾馬林固定48～72h,取穿刺部位,常規(guī)石蠟包埋,組織切片,HE染色。蛋白的免疫組化檢測:切片標本采用S-P免疫組化染色試劑盒(三鷹生物技術有限公司),根據(jù)說明書進行染色。一抗A20單克隆抗體(大鼠來源IG1,美國ACTIVEMOTIF公

25、司)濃度為1:300,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結果。選取各組各時相點的切片染色,每時間點6只動物,每只動物隨機取出3個層面,經(jīng)與本實驗不相關的2位工作人員光鏡下計數(shù)每個層面陽性細胞數(shù),取平均數(shù)即為每個標本平均陽性細胞數(shù),并對各時間點6只動物進行統(tǒng)計。本研究各組SD大鼠數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差((x)±s)表示,運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析,組間比較采用完全隨機設計資料的方差分析,組間多重比較采用LSD法

26、。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 結果：
　　 所有大鼠無死亡,各組大鼠活動進食等無明顯改變,實驗A組、B組和C組大鼠當天進食少,精神欠佳；所有大鼠無后肢癱瘓和排尿困難。術后8h,所有大鼠都完全清醒。B組(0.5％羅哌卡因)、C組(2％羅哌卡因)與對照組比較72h前的BBB評分有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。A組(0.9％NS)與對照組比較所有時間點均無統(tǒng)計學差異。2w各組大鼠脊髓運動功能均可恢復。HE染色:在脊髓穿刺

27、損傷部位可見充血與水腫,以8h最明顯,24h后逐步恢復。72h可見淋巴細胞、神經(jīng)膠質細胞數(shù)目增加。1w時淋巴細胞數(shù)目逐步正常。2％羅哌卡因組可見少量的神經(jīng)細胞壞死,但0.5％羅哌卡因組沒有發(fā)現(xiàn)壞死的神經(jīng)細胞。TFL的比較:術后8h,實驗組與對照組間TFL比較無統(tǒng)計學差異。術后72h,0.5％羅哌卡因組和2％羅哌卡因組與對照組相比TFL延長,有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。A組與對照組相比較無統(tǒng)計學差異。免疫組化染色結果:對照組各時間點脊髓

28、組織可見少量神經(jīng)元細胞胞質鋅指蛋白A20陽性表達,實驗組中A組、B組、C組三組均在術后8h可見A20表達陽性,鋅指蛋白A20陽性表達程度:C組>B組>A組,三組至24h時A20陽性表達達到高峰值,各組1w時陽性表達無統(tǒng)計學差異。
　　 結論：
　　 鋅指蛋白A20是機體的一種重要的內(nèi)源性抗炎因子,具有保護效應。羅哌卡因可誘發(fā)A20-過性高表達,對調控羅哌卡因作用于脊髓損傷后脊髓組織的炎癥反應引發(fā)的繼發(fā)性損傷具有重要保護意