Ⅰ群禽腺病毒分離鑒定及重組蛋白ELISA鑒別診斷方法的研究.pdf

1、禽腺病毒(FAV)歸為腺病毒科禽腺病毒屬，根據(jù)抗原性差異，分為3個群。Ⅰ群禽腺病毒(FAVI)具有共同的群抗原，共12個血清型(FAVI-FAV12)，在雞、鴨、鵝體內(nèi)普遍存在，呈隱性感染，與其他病原共同作用于家禽。2008-2010年從廣西南寧市活禽市場采集259份樣品，通過SPF雞胚傳代增殖與PCR鑒定，分離到92份FAV，陽性率為35.5％(92/259)。選取不同年份的8株，進(jìn)行血凝性、免疫瓊脂擴(kuò)散、形態(tài)學(xué)、致細(xì)胞病變和雞胚致病

2、性試驗。結(jié)果顯示，8株均不凝集雞紅細(xì)胞，能與FAVI陽性血清反應(yīng)，具有腺病毒粒子的典型特征，致細(xì)胞變圓、折光性增強，使雞胚發(fā)育不良。克隆8株hexon基因，經(jīng)序列分析，均與FAVI同源性最高。經(jīng)遺傳進(jìn)化分析，均與FAVI親緣關(guān)系最近，結(jié)果表明，8株分離株為FAVI。
　　 根據(jù)GenBank中FAVIhexon、penton、100K、33K基因序列，設(shè)計引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增，與pGEX-4T-1載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受

3、態(tài)細(xì)胞，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表明四種重組蛋白得到良好表達(dá)；經(jīng)可溶性分析，表明hexon、penton表達(dá)產(chǎn)物以包涵體的形式存在，100K、33K表達(dá)產(chǎn)物以可溶性的形式存在；經(jīng)純化，表明四種重組蛋白達(dá)到了較高的純度和濃度；經(jīng)western-blot檢測，具有良好的反應(yīng)原性，可作為間接ELISA的診斷抗原。
　　 以hexon和penton結(jié)構(gòu)蛋白分別作為包被抗原，建立檢測FAVI抗體的間接hexon-ELISA和penton-ELIS

4、A方法。結(jié)果表明，抗原最適包被濃度分別為10.0ug/mL和15.0ug/mL；一抗血清和最適稀釋度均為1:100；酶標(biāo)二抗最適稀釋度均為1:2000；一抗和二抗最適作用時間均分別為75min和45min。兩種ELISA方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性。以不同比例的hexon、penton兩種蛋白混合包被，建立hexon-penton-ELISA方法。用三種ELISA方法檢測野毒感染和滅活苗免疫血清各30份，結(jié)果表明兩種血清均有反應(yīng)

5、，hexon-penton-ELISA靈敏度更高。用三種ELISA方法檢測臨床樣品100份，陽性率分別為45％、41％、48％。為FAVI抗體的檢測和流行病學(xué)調(diào)查提供簡便、快速的血清學(xué)診斷方法。
　　 以100K和33K非結(jié)構(gòu)蛋白分別作為包被抗原，建立檢測FAVI抗體的間接100K-ELISA和33K-ELISA方法。結(jié)果表明，抗原最適包被濃度分別為10.8ug/mL和12.0ug/mL；-抗血清最適稀釋度均為1:100；酶標(biāo)二

6、抗最適稀釋度均為1:3000；一抗和二抗最適作用時間均分別為60min和45min。兩種方法具有良好的特異性、敏感性、重復(fù)性。以不同比例的100K、33K兩種蛋白混合包被，建立間接100K-33K-ELISA方法。用三種ELISA方法檢測野毒感染和滅活苗免疫血清各30份，表明100K-33K-ELISA靈敏度更高。用三種ELISA方法檢測臨床樣品100份，陽性率分別為40％、35％、42％。該方法可檢出FAVI野毒感染血清，而與滅活苗免