鴨坦布蘇病毒巢式PCR檢測方法及其重組E蛋白間接ELISA診斷方法的研究.pdf

1、2010年4月以來，我國東南部分地區(qū)飼養(yǎng)的種鴨和蛋鴨爆發(fā)了鴨坦布蘇病毒病，以產(chǎn)蛋急劇下降為特點(diǎn)，給養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的損失，因此有必要建立一種快速、敏感、特異的診斷方法。分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展為黃病毒屬病毒的快速診斷帶來了新的策略。
　　 參照GenBank已登錄的黃病毒基因序列設(shè)計(jì)黃病毒通用引物，建立了基于黃病毒通用引物的高敏感巢式PCR檢測方法，為黃病毒、特別是新發(fā)黃病毒提供了高效的檢測方法。該方法通過序列的比對(duì)，選擇NS5基因

2、保守區(qū)設(shè)計(jì)了兩對(duì)通用簡并引物FlavP1-FlavP4，在此基礎(chǔ)上建立了巢式PCR檢測方法，并應(yīng)用到鴨坦布蘇病毒(ducktembusuvirus，DTV)的檢測中。該方法僅能擴(kuò)增鴨坦布蘇病毒目的基因而不能擴(kuò)增其他病毒，且敏感性達(dá)到90個(gè)拷貝·μL-1，比普通PCR高出1000倍。以上結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的黃病毒引物具有良好的敏感性和特異性，其巢式PCR敏感性高，并成功的進(jìn)行了鴨坦布蘇病毒的檢測。同源性和進(jìn)化分析表明，新發(fā)黃病毒屬蚊媒黃病毒類

3、恩塔亞病毒群，與坦布蘇病毒及近期報(bào)道的鴨坦布蘇病毒分離株BYD關(guān)系最近。本研究表明該檢測方法可以用于該病的臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查，并闡明了鴨坦布蘇病毒的進(jìn)化地位。
　　 包膜蛋白(E蛋白)是黃病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、細(xì)胞趨向性、病毒毒力和誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)中起重要作用。從規(guī)?；B(yǎng)鴨場分離到6株鴨坦布蘇病毒，并采用特異性引物成功擴(kuò)增出E蛋白基因。結(jié)果表明，E基因全長1503bp，編碼501個(gè)氨基酸，序列高度保

4、守。將E基因克隆到pMD18-T載體中，經(jīng)酶切鑒定和序列測定無誤后，再將該基因克隆到表達(dá)載體pET21a中，并轉(zhuǎn)化E.coli后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。采用原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)E基因進(jìn)行了表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析，E蛋白大小54.3kDa，主要以包涵體形式存在。Westernblot分析結(jié)果表明，表達(dá)經(jīng)親和層析法純化后的蛋白能與陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。親和層析法從表達(dá)產(chǎn)物中純化目的蛋白，從而為制備鴨坦布蘇病毒實(shí)驗(yàn)室診斷抗原和分析E蛋白的基因結(jié)構(gòu)與功

5、能的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
　　 中和試驗(yàn)(NT)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)是目前診斷黃病毒感染的最特異方法，然而中和試驗(yàn)耗時(shí)較長，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為建立快速檢測鴨坦布蘇病毒的血清學(xué)方法，以純化的表達(dá)產(chǎn)物作為包被抗原，初步建立了針對(duì)E蛋白抗體的間接ELISA檢測方法。對(duì)ELISA各種反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索，確定了最適工作條件。優(yōu)化后確定的抗原最適包被濃度為7μg/mL，血清的最佳稀釋度為1:320,酶標(biāo)抗體最適稀釋度為1:1000。在優(yōu)化條件下，陰