F蛋白裂解位點(diǎn)修飾與外源基因重組病毒表達(dá)對(duì)重組LaSota病毒組織親嗜性和致病性的研究.pdf

1、重組新城疫病毒(NDV)作為活病毒載體疫苗具有很多的優(yōu)點(diǎn)，NDV弱毒疫苗安全、有效、遺傳穩(wěn)定、使用方便、生產(chǎn)成本低廉。重組NDV應(yīng)用廣泛，但是重組NDV存在著免疫機(jī)理不清楚，免疫效果不理想，使用方法不明確等問(wèn)題。為了優(yōu)化重組NDV，本實(shí)驗(yàn)就重組NDV的免疫機(jī)制、應(yīng)用等方面做了進(jìn)一步探索和研究。 1、反向遺傳操作重組新城疫病毒(rLaSota)對(duì)SPF雞氣管黏膜損傷研究及病毒組織嗜性研究本研究用課題組通過(guò)反向基因操作系統(tǒng)獲得的感染

2、性拯救病毒rLaSota按常規(guī)劑量106EID50(100μL/羽)，一次免疫2日齡、10日齡和20日齡SPF雛雞，分別在接種后的第1、3、5、10、15、18d剖檢取氣管，利用組織病理學(xué)和超微病理學(xué)檢測(cè)氣管黏膜的損傷程度，另外對(duì)免疫的2日齡雛雞取肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟，腺胃和十二指腸；利用免疫組化方法檢測(cè)重組疫苗株在雛雞體內(nèi)的組織嗜性。結(jié)果表明，用rLaSota接種的2日齡、10日齡和20日齡SPF雛雞，均沒(méi)有表現(xiàn)明顯臨床癥狀，

3、組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)氣管黏膜巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，黏膜固有層水腫，黏膜上皮細(xì)胞空泡化。掃描電鏡觀察氣管發(fā)現(xiàn)，杯狀細(xì)胞在接種后超常增生，纖毛細(xì)胞脫纖毛，黏液成分增多，在氣管黏膜表面有球形粒子，這也可能是機(jī)體免疫機(jī)制的表現(xiàn)。免疫組化結(jié)果表明rLaSota只在肝臟中的肝細(xì)胞中復(fù)制。 2、不同外源基因插入構(gòu)建的表達(dá)vvIBDV株VP2抗原和表達(dá)H5亞型重組重組NDV活載體疫苗對(duì)氣管黏膜的損傷及病毒組織嗜性的研究本研究用課題組通過(guò)

4、反向基因操作系統(tǒng)獲得的感染性拯救病毒重組疫苗株rLasota-HAmut(GD)和rLaSota-VP2分別按常規(guī)劑量106EID50(100μL/羽)一次免疫2日齡、10日齡和20日齡SPF雛雞，分別在接種后的第1、3、5、10、15、18d剖檢取氣管，利用組織病理學(xué)和超微病理學(xué)檢測(cè)氣管黏膜的損傷程度。另外對(duì)2日齡雛雞取肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟，腺胃、十二指腸利用免疫組化方法檢測(cè)重組病毒三雛雞體內(nèi)組織嗜性。 結(jié)果表明，在免

5、疫rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)時(shí)，不同日齡接種，雛雞均未表現(xiàn)出明顯臨床癥狀；組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)氣管黏膜損傷程度與rLasota相似；掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，外源基因的插入的重組疫苗株對(duì)氣管黏膜的損傷因外源基因的不同，損傷程度不同，HAmut(GD)對(duì)rLaSota疫苗株有較強(qiáng)的致弱型，rLaSota-HAmut(GD)對(duì)氣管黏膜的損傷程度減弱，電鏡觀察在氣管黏膜有大量的球形粒子。VP2基因?qū)LaSota疫苗株的

6、致弱性不強(qiáng)，用rLaSota-VP2接種的雛雞氣管黏膜損傷程度與rLaSota相似，電鏡觀察在氣管黏膜有球形粒子。免疫組化結(jié)果表明外源基因HAmut(GD)、VP2的插入對(duì)rLaSota病毒組織嗜性影響不大。rLaSota-HAmut(GD)接種后能在肝臟、肺臟檢測(cè)到病毒，rLaSota-VP2與rLaSota相同，接種后能在肝臟檢測(cè)到病毒。這說(shuō)明rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)毒力不強(qiáng)，而且不同、日齡接種SP

7、F雞后，對(duì)雛雞造成的氣管黏膜損傷程度沒(méi)有太明顯的區(qū)別，因此rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)可用在較小日齡的初次免疫。 3、表達(dá)vvIBDV株VP2抗原重組NDV活載體疫苗、表達(dá)H5亞型重組活載體疫苗F蛋白裂解位點(diǎn)突變后構(gòu)建的重組病毒對(duì)SPF雞氣管粘膜損傷及組織嗜性的研究在前期實(shí)驗(yàn)中，將rLasota-HAmut(GD)和rLaSota-VP2F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基酸由分別設(shè)計(jì)突變引物將F蛋白裂解位點(diǎn)的氨基

8、酸112G-R-Q-G-R↓L117突變?yōu)?12R-R-Q-R-R↓F117，112R-R-Q-R-R↓L117命名為r1-F(M)-F，rl-F(M)-L，并拯救重組病毒。命名為r1-F(M)-F-HA，r1-F(M)-L-HA，r1-F(M)-F-VP2。分別按每只雞常規(guī)劑量106EID50(100μL/羽)免疫2日齡SPF雛雞，分別在接種后的第1、3、5、10、15、18d取氣管、肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟、腺胃、十二指腸，利用

9、組織病理學(xué)檢測(cè)氣管黏膜的損傷程度，利用免疫組化方法檢測(cè)重組病毒大雛雞體內(nèi)組織嗜性，研究F蛋白裂解位點(diǎn)突變對(duì)病毒組織嗜性的影響。 結(jié)果表明，重組毒株接種后，雛雞均未表現(xiàn)任何明顯臨床癥狀；組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)氣管黏膜損傷程度加大，幾乎無(wú)完整的結(jié)構(gòu):免疫組化結(jié)果表明rLaSota-VP2、rLaSota-HAmut(GD)疫苗株F蛋白裂解位點(diǎn)突變后r1-F(M)-F-HA，r1-F(M)-L-HA，r1-F(M)-F-VP2對(duì)病毒的組織

10、嗜性的影響比較大，均能在肝臟、肺臟、腎臟、大腦、脾臟、腺胃、十二指腸檢測(cè)到病毒。這說(shuō)明F蛋白裂解位點(diǎn)突變后氣管黏膜損傷嚴(yán)重，組織嗜性較廣，F(xiàn)蛋白裂解位點(diǎn)突變大大加大了rLaSota-VP2、rLaSota-HAmu(GD)的毒力和組織嗜性；r1-F(M)-F-HA，r1-F(M)-L-HA，r1-F(M)-F-VP2，適合較大日齡的雛雞接種，他們均可用于雛雞的加強(qiáng)免疫。 本研究是國(guó)內(nèi)、外首次用rLaSota為載體的重組病毒接種后