高糖環(huán)境下miR-29c通過Tristetraprolin影響小鼠足細(xì)胞中炎性因子的表達.pdf

1、背景：糖尿病腎病（DN）是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥，在全球范圍內(nèi)廣泛流行，是終末期腎臟病（ESRD）最常見的病因。糖尿病腎病的發(fā)病機制比較復(fù)雜，目前尚不十分明確。越來越多的證據(jù)表明炎癥激活在糖尿病腎病的發(fā)病機制中起促進作用。Tristetraprolin（TTP）是一種RNA結(jié)合蛋白，可與多種信使RNA（RNA）的3’非編碼區(qū)（UTR）含有的AU重復(fù)序列（ARE）結(jié)合，促進靶mRNA的降解。已經(jīng)證實，TTP可與多種炎性因子如白介素家族中的IL

2、-6和TNF-α的mRNA結(jié)合并介導(dǎo)其降解，因此TTP又稱為“抗炎蛋白”。在糖尿病腎病患者的血清、尿液中，隨著尿蛋白的增加，TTP的表達降低，炎性因子IL-6、IL-18的表達升高，且TTP的表達變化發(fā)生在炎性因子之前，因此TTP可能參與了糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)。微小RNA（MicroRNAs）是一類從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達的內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子RNA，一般由20-22個核苷酸組成。其與靶mRNA的3’UTR區(qū)的堿基完全或不完全配對結(jié)

3、合，導(dǎo)致mRNA的降解或抑制蛋白翻譯過程。我們前期基因芯片的結(jié)果顯示，miR-29c在糖尿病腎病患者血漿、尿沉渣、腎組織中均有差異表達。有文獻報道，miR-29c參與糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展，抑制miR-29c的表達可以延緩DN的進展。但是miR-29c是否參與糖尿病腎病的炎癥反應(yīng)，目前尚未見相關(guān)文獻報道。我們應(yīng)用TargetScan軟件分析發(fā)現(xiàn)TTP可能是miR-29c的靶基因。由此我們提出假設(shè)，在高糖環(huán)境下的小鼠足細(xì)胞中miR-29c通

4、過TTP調(diào)控炎性因子的表達，進而參與炎癥反應(yīng)。
　　目的：本實驗通過觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞中miR-29c、TTP及炎性因子IL-6、TNF-α的表達變化，以及改變miR-29c的表達后TTP及炎性因子IL-6、TNF-α的表達變化，探討 miR-29c是否參與高糖環(huán)境下的炎癥反應(yīng)，并驗證這種作用是否通過TTP介導(dǎo)，為糖尿病腎病發(fā)病機制和診治提供新的理論依據(jù)。
　　方法：⑴體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞并分為如下三組：正常組（5.6m

5、mol/L D-葡萄糖）、高糖組（25mmol/L D-葡萄糖）、高滲組（5.6mmol/L D-葡萄糖+19.4mmol/L D-甘露醇），分別于不同培養(yǎng)時間下進行檢測。qRT-PCR檢測 miR-29c，TTP及IL-6、TNF-αmRNA表達水平，western blot檢測TTP的蛋白表達水平，ELISA檢測IL-6、TNF-α蛋白表達水平。觀察高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞中miR-29c、TTP及炎性因子IL-6、TNF-α的表達變化

6、。⑵構(gòu)建野生型和突變型TTP3’UTR雙熒光素酶質(zhì)粒，分別與miR-29c mimics共轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞，并設(shè)立轉(zhuǎn)染對照組，轉(zhuǎn)染36h后裂解細(xì)胞，應(yīng)用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測熒光素酶活性，驗證TTP是否是miR-29c的靶基因。⑶將miR-29c mimics和inhibitor分別轉(zhuǎn)染入正常糖濃度下培養(yǎng)的小鼠足細(xì)胞，并設(shè)立正常對照組和轉(zhuǎn)染對照組，分別于不同培養(yǎng)時間下進行檢測。qRT-PCR檢測miR-29c，TTP及IL-6、

7、TNF-αmRNA表達水平，western blot檢測 TTP的蛋白表達水平，ELISA檢測 IL-6、TNF-α蛋白表達水平。觀察改變miR-29c的表達后，TTP及炎性因子IL-6、TNF-α的表達變化。⑷體外培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞并分為如下四組：正常組（5.6mmol/L D-葡萄糖）、高糖組（25mmol/L D-葡萄糖）、高糖轉(zhuǎn)染inhibitor組（25mmol/L D-葡萄糖+miR-29c inhibitor）、高糖轉(zhuǎn)染對照組

8、（25mmol/L D-葡萄糖+miR-control），分別于不同培養(yǎng)時間下進行檢測。qRT-PCR檢測 miR-29c，TTP及 IL-6、TNF-αmRNA表達水平，western blot檢測TTP的蛋白表達水平，ELISA檢測IL-6、TNF-α蛋白表達水平。觀察高糖環(huán)境下，改變miR-29c的表達后，TTP及炎性因子IL-6、TNF-α的表達變化。
　　結(jié)果：①與正常對照組相比，高糖組miR-29c的表達明顯升高，TT

9、P蛋白及mRNA的表達降低，IL-6、TNF-α蛋白及 mRNA的表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。②成功構(gòu)建野生型和突變型TTP3’UTR-pmirGLO質(zhì)粒，分別與miR-29c mimics共轉(zhuǎn)染小鼠足細(xì)胞。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，與突變型 TTP3’UTR和miR-29c mimics共轉(zhuǎn)染組相比，野生型TTP3’UTR和miR-29c mimics共轉(zhuǎn)染組檢測到的熒光降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）

10、。與正常對照組相比，miR-29c inhibitor轉(zhuǎn)染組TTP蛋白及mRNA的表達升高，miR-29c mimics轉(zhuǎn)染組TTP蛋白及mRNA的表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。③與正常對照組相比，miR-29c inhibitor轉(zhuǎn)染組IL-6、TNF-α蛋白及mRNA的表達降低，miR-29c mimics轉(zhuǎn)染組IL-6、TNF-α蛋白及mRNA的表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。④與正常對照組相比，高糖

11、組TTP蛋白及mRNA的表達降低，IL-6、TNF-α蛋白及mRNA的表達升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與高糖組相比，高糖轉(zhuǎn)染miR-29c inhibitor組TTP蛋白及mRNA的表達增加，IL-6、TNF-α蛋白及mRNA的表達降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。
　　結(jié)論：⑴高糖影響小鼠足細(xì)胞中miR-29c及炎性因子IL-6、TNF-α的表達。⑵TTP是miR-29c的靶基因。⑶高糖環(huán)境下，miR-29