王鴿α-Syn基因克隆及AVM急性中毒對其在腦組織中表達的影響.pdf

1、α-突觸核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)是一個由140個氨基酸殘基構成的酸性蛋白,在腦組織中高度表達,主要聚集在神經(jīng)元突觸前末梢,在神經(jīng)元的發(fā)育與形成、多巴胺合成、保持突觸可塑性及突觸囊泡的運輸過程中發(fā)揮重要作用。相對于哺乳動物,禽類α-Syn的研究相對滯后,而關于王鴿α-Syn基因序列及其在王鴿腦內(nèi)的分布還未見報道。
　　 本研究應用分子生物學技術克隆一段覆蓋王鴿α-Syn完整編碼區(qū)的序列;使用DNAMAN和DNA

2、Star軟件對人、黑猩猩、牛、豬、王鴿、原雞、斑胸草雀及小鼠8種物種α-SyncDNA編碼區(qū)核苷酸和氨基酸序列進行比對,并構建生物進化樹;利用基因工程技術在原核表達系統(tǒng)中表達了α-Syn并制備了多克隆抗體;應用免疫組化方法檢測了王鴿腦組織中α-Syn的分布及阿維菌素(Avermectin,AVM)急性中毒對王鴿腦組織中α-Syn蛋白表達的影響,結(jié)果表明:
　　 1成功克隆了613bp的王鴿α-SyncDNA序列,其中包括ORF4

3、32bp,起始密碼子ATG,終止密碼子TGA,5'UTR區(qū)域16bp,3'UTR區(qū)域165bp,王鴿α-Syn由143個氨基酸殘基組成,蛋白分子量為14.9kDa。
　　 2王鴿與其他7個物種α-Syn編碼區(qū)核苷酸序列同源性在81.71/～93.52％之間,與原雞和斑胸草雀同源性最高均為93.52％,與黑猩猩的為83.80％,與人的為83.60％,與豬的為83.56％,與小鼠的為82.87％,與牛的為81.71％,王鴿與其他7種

4、物種α-Syn氨基酸序列的同源性在83.22％～97.20％之間,說明不同物種間α-Syn基因高度保守,提示王鴿與其他已知物種α-Syn的功能相似。
　　 3在大腸桿菌表達系統(tǒng)中成功表達了pGEX6p-1-α-Syn融合蛋白,制備出兔抗王鴿α-Syn的多克隆抗體,采用間接ELISA檢測抗體的效價為1:51200,采用Westernblot檢測出多克隆抗體對于融合蛋白具有特異性。
　　 4王鴿海馬、丘腦、嗅球、視葉、小腦5

5、個部位中均檢測到α-Syn,含量高低依次為海馬、嗅球、丘腦、視葉和小腦,表明α-Syn在王鴿腦內(nèi)分布廣泛,并且分布具有差異性。
　　 5AVM急性中毒后,王鴿海馬、丘腦、嗅球、視葉和小腦5個部位中α-Syn蛋白表達均升高,海馬、丘腦和嗅球的α-Syn表達與對照組相比差異顯著(P＜0.05),而視葉和小腦與對照組相比差異不顯著(P＞0.05),表明AVM急性中毒后,腦不同部位α-Syn表達量的升高具有差異性,提示AVM急性中毒引起