SA-HA水凝膠包載hUC-MSCs治療大鼠腦損傷模型的研究.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷（Traumatic Brain Injury,TBI)是指由外部因素作用于頭部導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺損性疾病，具有高發(fā)病率、高致死率和高致殘率等特點(diǎn)，給社會(huì)和家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)，尋找積極有效的治療方法是目前亟待解決的問(wèn)題。干細(xì)胞替代療法給 TBI治療提供了新的策略和希望，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）來(lái)源于人臍帶沃頓膠組織，具有無(wú)倫

2、理學(xué)爭(zhēng)議，來(lái)源廣泛，多向分化潛能、低免疫原性等特點(diǎn)，是組織工程良好的種子細(xì)胞。然而移植后成活率低、數(shù)量不足等問(wèn)題仍然制約著干細(xì)胞移植的應(yīng)用。因此，提供適合移植干細(xì)胞生長(zhǎng)與存活的微環(huán)境對(duì)于提高干細(xì)胞生物學(xué)活性和治療效果至關(guān)重要。
　　藻酸鹽（sodium alginate，SA）水凝膠組織工程支架具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，與細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）具有天然相似性，可為細(xì)胞生長(zhǎng)提供立體支撐，且為細(xì)胞的氣體

3、交換、營(yíng)養(yǎng)輸送及其新陳代謝產(chǎn)物的排出提供良好的傳輸通道。透明質(zhì)酸（hyaluronan,HA）作為天然細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分之一，可與干細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，促進(jìn)干細(xì)胞的增殖、粘附，幫助信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控細(xì)胞分化。因此，本課題通過(guò)構(gòu)建SA/HA組織工程支架，聯(lián)合hUC-MSCs研究對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷模型鼠的治療作用。
　　目的
　　本實(shí)驗(yàn)利用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建SA/HA復(fù)合功能支架，并對(duì)其物化性能等進(jìn)行表征，對(duì)包載hUC-MSCs

4、的SA/HA水凝膠支架進(jìn)行生物學(xué)評(píng)價(jià)，以提供更適合hUC-MSCs生存的微環(huán)境；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，探究hUC-MSCs聯(lián)合SA/HA水凝膠支架對(duì) TBI大鼠的神經(jīng)修復(fù)作用及其可能的作用機(jī)制，以期為干細(xì)胞移植治療TBI提供新的策略和方法。
　　方法
　　1體外實(shí)驗(yàn)研究SA/HA水凝膠支架與hUC-MSCs相容性評(píng)價(jià)
　　通過(guò)內(nèi)部凝膠法制備4組不同配比的藻酸鹽水凝膠，分別為1％-0.8、1%-0.5、0.5%-0.5、0.5%

5、-0.2；掃描電子顯微鏡（SEM）進(jìn)行水凝膠形貌表征；試管傾斜法檢測(cè)不同配比的凝膠時(shí)間；冷凍干燥及稱(chēng)重法測(cè)定不同配比的含水率及降解性能；流變儀檢測(cè)不同配比的彈性模量；流式細(xì)胞儀檢測(cè) hUC-MSCs的表面標(biāo)記物；通過(guò)添加一定比例的透明質(zhì)酸，SA與HA濃度比分別為4:1（S4H1）、2:1（S2H1），構(gòu)建不同配比SA/HA水凝膠支架，包載hUC-MSCs，共分三組，分別為單獨(dú) SA組、S4H1組、S2H1組；通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察 h

6、UC-MSCs在水凝膠中三維分布；Live-Dead染色法檢測(cè)干細(xì)胞在不同分組中的存活；CCK-8檢測(cè)不同分組中干細(xì)胞的增殖情況。
　　2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究SA/HA水凝膠支架聯(lián)合hUC-MSCs對(duì)TBI大鼠的神經(jīng)修復(fù)作用
　　采用落體撞擊法（Feeney's weight-drop）構(gòu)建大鼠創(chuàng)傷性腦損傷模型，隨機(jī)分為NaCl組、scaffold組、hUC-MSCs組和scaffold+ hUC-MSCs組。CV染色觀察大鼠腦缺損

7、情況；mNSS評(píng)分評(píng)估大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)；Morris水迷宮法檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力；取出大鼠腦組織，做冰凍切片；免疫組化檢測(cè)腦內(nèi)hUC-MSCs的存活和遷移；免疫熒光檢測(cè)神經(jīng)元標(biāo)記物β-III Tubulin和細(xì)胞增殖Ki67的陽(yáng)性表達(dá)；提取損傷側(cè)腦組織蛋白和RNA，Western Blot、qRT-PCR檢測(cè)組織神經(jīng)分化相關(guān)蛋白和基因（NSE、NEUN、MAP2）的表達(dá)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 BDNF、NGF、NT3的表達(dá)變化，細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋

8、白Bcl2的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　1、通過(guò)內(nèi)部凝膠法制備的藻酸鹽水凝膠外觀呈半透明狀，外形可根據(jù)所用模具的不同任意塑性；通過(guò)SEM表征結(jié)果顯示，水凝膠內(nèi)部呈三維多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。凝膠時(shí)間、含水率、降解率隨著SA濃度、f值的減小而呈上升趨勢(shì)，彈性模量隨著 SA濃度、f值的減小而下降。通過(guò)添加適當(dāng)比例透明質(zhì)酸，檢測(cè)hUC-MSCs在水凝膠中的活性發(fā)現(xiàn)，與SA組相比，S4H1、S2H1組中細(xì)胞存活率提高（P<0.05）、細(xì)胞增殖能力上

9、升（P<0.05），且與HA濃度呈正相關(guān)。
　　2、通過(guò)落體撞擊法成功構(gòu)建大鼠腦創(chuàng)傷模型；mNSS評(píng)分評(píng)估發(fā)現(xiàn)，治療組運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)顯著（P<0.05）；hUC-MSCs組和scaffold+hUC-MSCs組均能改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，且聯(lián)合組效果更加顯著（P<0.05）；hUC-MSCs聯(lián)合支架可減少干細(xì)胞于病灶部位的流失，顯著增加損傷部位移植的細(xì)胞數(shù)目（P<0.05）；治療組中β-III Tubulin和Ki67表達(dá)增加；損傷側(cè)

10、腦組織中，NSE、NEUN、MAP2、BDNF、Bcl2蛋白表達(dá)上升（P<0.05），NEUN、MAP2、BDNF、NGF、NT3基因表達(dá)水平提高（P<0.05），且聯(lián)合組效果更加明顯。
　　結(jié)論
　　1、內(nèi)部凝膠法可制備任意塑形的可注射性藻酸鹽水凝膠，通過(guò)調(diào)整海藻酸鈉濃度、f值的配比，可調(diào)控水凝膠的理化性質(zhì)。
　　2、藻酸鹽水凝膠支架可為hUC-MSCs生長(zhǎng)提供三維立體支撐，添加透明質(zhì)酸后，藻酸鹽/透明質(zhì)酸復(fù)合水凝膠