NDM-1耐藥菌在中國(guó)的流行及特性研究.pdf

1、目前，我國(guó)產(chǎn)NDM-1耐藥菌的流行情況、攜帶NDM-1菌株的特性及其播散的機(jī)制仍不清楚。國(guó)外NDM-1攜帶者多有印度和巴基斯坦旅行和醫(yī)療史，印度被認(rèn)為是NDM-1耐藥菌的輸出國(guó)家，我國(guó)與印度毗鄰，其N(xiāo)DM-1耐藥菌的流行是否和印度有關(guān)仍沒(méi)有明確定論。
　　研究證明人體腸道是重要的耐藥基因庫(kù)，致病菌可以在腸道內(nèi)發(fā)生接合轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因，在腸道定植的菌中攜帶的耐藥基因有一半與致病菌中相同，因此美國(guó)疾病預(yù)防控制中心推薦通過(guò)采集患者糞便標(biāo)

2、本來(lái)篩查CRE（耐碳青霉烯類抗生素的腸桿菌科細(xì)菌）攜帶者，以便及時(shí)采取措施預(yù)防和控制感染。基于上述研究，從2011年4月至2011年10月，在全國(guó)范圍內(nèi)選取了11個(gè)城市22家醫(yī)院，共收集了3001份糞便樣本，常規(guī)PCR和陽(yáng)性產(chǎn)物再測(cè)序篩選NDM-1陽(yáng)性樣本，然后從鑒定為陽(yáng)性的樣本中分離出NDM-1耐藥菌，利用BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)和16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。其中對(duì)分離出的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌再次利用16S-23S rRNA

3、 ITS區(qū)序列和rpoB基因序列測(cè)序進(jìn)行菌種鑒定。
　　在篩查的3001份樣本中，一共鑒定出329份陽(yáng)性樣本，平均陽(yáng)性率為11％，陽(yáng)性率較高的城市有重慶(17.6％)和成都(17.2％)，較低的有南京(4.0％)和烏魯木齊(4.4％)，在所有調(diào)查的城市中均存在陽(yáng)性樣本。從329份陽(yáng)性的菌液中，一共分離出63株NDM-1陽(yáng)性菌，菌種鑒定結(jié)果顯示數(shù)目最多的是不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌（30株），其次是腸球菌（10株）。含NDM-1的菌種種類較多，

4、分別屬于不同的16個(gè)屬的細(xì)菌，其中共發(fā)現(xiàn)18個(gè)未報(bào)道過(guò)的含NDM-1的耐藥菌。另外發(fā)現(xiàn)有些陽(yáng)性樣本分離出不止一株NDM-1耐藥菌，其中有9個(gè)樣本每個(gè)樣本分離出2個(gè)不同的NDM-1耐藥菌，還有1個(gè)樣本分離出3株不同的NDM-1陽(yáng)性菌，在這10個(gè)特殊的樣本中有9個(gè)樣本中分離的菌中含有不動(dòng)桿菌。另外病例資料顯示收集的患者均無(wú)出國(guó)醫(yī)療史。
　　通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)NDM-1耐藥菌在醫(yī)院患者身上攜帶率較高，已經(jīng)在全國(guó)范圍內(nèi)流行和傳播;我國(guó)分離的

5、NDM-1菌株的菌種類型獨(dú)特，以不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌(30/63)和腸球菌屬細(xì)菌(10/63)多見(jiàn);不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌在中國(guó)NDM-1的傳播過(guò)程中起到了重要作用，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌可能是NDM-1基因的保存宿主;我國(guó)的NDM-1耐藥菌的流行與印度可能無(wú)關(guān)。
　　對(duì)NDM-1耐藥菌的特性進(jìn)行了進(jìn)一步研究，首先在有抗和無(wú)抗條件下連續(xù)傳代，分析blaNDM-1基因在菌株中的遺傳穩(wěn)定性。Walsh等的研究表明不能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株不具

6、備典型的NDM-1耐藥菌的耐藥性，所以對(duì)能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因的菌株進(jìn)行重點(diǎn)研究，首先微量肉湯稀釋法和E-test法檢測(cè)菌株對(duì)抗菌藥物的敏感性，E-test法檢測(cè)細(xì)菌金屬酶表型;然后PCR法篩選常見(jiàn)的耐藥基因，分析菌株的耐藥基因背景;PFGE對(duì)細(xì)菌分型，查看有無(wú)流行克隆株;Southern blot對(duì)blaNDM-1進(jìn)行基因定位;接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)評(píng)估blaNDM-1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移特性，同時(shí)微量肉湯稀釋法評(píng)估了blaNDM-1陽(yáng)性接合子的

7、耐藥性。
　　發(fā)現(xiàn)在63株NDM-1耐藥菌中只有30株不動(dòng)桿菌屬的細(xì)菌能夠穩(wěn)定遺傳blaNDM-1基因，在有抗和無(wú)抗的壓力下連續(xù)培養(yǎng)5代，所有的菌株未出現(xiàn)blaNDM-1基因丟失現(xiàn)象，然而其余菌株，包括一株大腸埃希菌和產(chǎn)酸克雷伯菌在內(nèi)的15個(gè)屬種的細(xì)菌在無(wú)抗的壓力下連續(xù)傳代培養(yǎng)1-3代，blaNDM-1基因均發(fā)生丟失。體外的藥敏實(shí)驗(yàn)表明30株不動(dòng)桿菌表現(xiàn)出相似的表型耐藥模式，對(duì)頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)出高水平耐藥，對(duì)氨基糖

8、苷類抗生素、喹諾酮類抗生素及單酰胺環(huán)類抗生素（氨曲南）耐藥表現(xiàn)不一致:10株測(cè)試菌對(duì)氨基糖苷類抗生素表現(xiàn)為敏感，其余菌株(20/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥;3株測(cè)試菌對(duì)喹諾酮類抗生素表現(xiàn)為敏感，其余菌株(27/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥;17株測(cè)試菌對(duì)氨曲南表現(xiàn)為敏感，其余菌株(13/30)表現(xiàn)為耐藥或中度耐藥;30株測(cè)試株中，29株對(duì)替加環(huán)素表現(xiàn)為敏感，24株對(duì)黏菌素表現(xiàn)為敏感。攜帶NDM-1的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌金屬酶表型均為陽(yáng)性。耐藥基

9、因背景篩查結(jié)果顯示在30株不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌，有22株細(xì)菌含有其他耐藥基因。PFGE結(jié)果顯示不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌帶型差異較大，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)克隆株。Southern blot結(jié)果顯示30個(gè)不動(dòng)桿菌中有26個(gè)菌blaNDM-1位于質(zhì)粒上，質(zhì)粒大小相似，在30-60kb范圍內(nèi)，其余4個(gè)菌blaNDM-1位于染色體上。接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)顯示有23個(gè)菌株中的blaNDM-1質(zhì)粒發(fā)生了轉(zhuǎn)移，接合轉(zhuǎn)移效率較高，達(dá)到10-2，同時(shí)藥敏結(jié)果顯示陽(yáng)性接合子普遍對(duì)頭孢菌素類

10、抗生素表現(xiàn)為耐藥，然而只有部分菌株(8/23)遺傳NDM-1原始菌株的耐藥性，對(duì)碳青霉烯類抗生素表現(xiàn)耐藥，其余接合子(15/23)對(duì)其表現(xiàn)敏感。
　　通過(guò)上述研究發(fā)現(xiàn)NDM-1陽(yáng)性的不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌并非泛耐藥菌，體外實(shí)驗(yàn)表明除替加環(huán)素和黏菌素外，多數(shù)菌株還對(duì)氨曲南保持敏感。blaNDM-1基因能夠穩(wěn)定地存在于不動(dòng)桿菌攜帶的質(zhì)粒上，并且這些質(zhì)粒能夠高效地發(fā)生接合轉(zhuǎn)移，這對(duì)blaNDM-1基因的傳播具有重要意義。
　　為了研究bl

11、aNDM-1基因所在的質(zhì)粒及周?chē)蛄刑卣鳎云趶姆肿铀缴辖沂灸退幓虻漠a(chǎn)生及傳播機(jī)制。本研究提取細(xì)菌的質(zhì)粒利用Ion TorrentTM平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，然后普通PCR測(cè)序補(bǔ)充gap，同時(shí)驗(yàn)證質(zhì)粒全序。RAST對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行注釋，Blastp進(jìn)行驗(yàn)證。利用Mauve和CLC Genomics Workbench軟件對(duì)所有blaNDM-1質(zhì)粒進(jìn)行分析，對(duì)比所有的質(zhì)粒，找出它們的區(qū)別和差異，同時(shí)對(duì)blaNDM-1基因上下游序列進(jìn)行分析，對(duì)于bla

12、NDM-1基因位于染色體上的4個(gè)菌，PCR mapping推測(cè)其上下游序列。結(jié)合有關(guān)NDM-1的文獻(xiàn)，推測(cè)NDM-1的傳播和流行規(guī)律。
　　blaNDM-1質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果顯示，有14個(gè)質(zhì)粒與已經(jīng)公布的4個(gè)質(zhì)粒相同（pNDM-BJ01、pNDM-BJ02、pM131_NDM-1和pAbNDM-1），這4個(gè)質(zhì)粒本身之間相似性較高，達(dá)到80％;另外10個(gè)質(zhì)粒為新的質(zhì)粒，對(duì)比分析之后，發(fā)現(xiàn)這10個(gè)質(zhì)粒與上述的4個(gè)質(zhì)粒仍然有較高的相似性(70

13、％-90％)。由此得到不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中blaNDM-1質(zhì)粒保守，質(zhì)粒間的相似程度較高，質(zhì)粒的不同多為在轉(zhuǎn)移的過(guò)程中不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中常見(jiàn)的插入序列整合引起的。
　　同時(shí)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)結(jié)構(gòu)全新的質(zhì)粒，pNDM-GJ01和pNDM-GJ02，pNDM-GJ01擁有一個(gè)新的質(zhì)粒骨架，BLAST結(jié)果顯示除了Tn125外，NCBI中沒(méi)有與pNDM-GJ01相似的序列。另外對(duì)pNDM-GJ02的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析顯示，質(zhì)粒pNDM-GJ02上有兩段分別

14、與鮑曼不動(dòng)桿菌中質(zhì)粒pBJAB0715和Acinetobacter sp.MDS7A染色體上序列有較高的同源性(97％-100％)，除此之外，質(zhì)粒還含兩個(gè)完整的復(fù)合轉(zhuǎn)座子，Tn125和IS26復(fù)合轉(zhuǎn)座子，pNDM-GJ02質(zhì)粒的形成可能是由多次重組事件造成的。由此不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中blaNDM-1新質(zhì)粒的產(chǎn)生是Tn125移動(dòng)整合的結(jié)果。blaNDM-1基因通過(guò)轉(zhuǎn)座元件在不同質(zhì)粒間傳播，繼而以質(zhì)粒為轉(zhuǎn)移元件繼續(xù)播散。
　　通過(guò)比對(duì)30

15、株不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌中blaNDM-1基因周?chē)蛄?，發(fā)現(xiàn)blaNDM-1位于Tn125-like結(jié)構(gòu)上，周?chē)蛄蟹浅１Ｊ?。結(jié)合文獻(xiàn)認(rèn)為blaNDM-1基因可能來(lái)源于不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌，不動(dòng)桿菌屬細(xì)菌是blaNDM-1基因的天然宿主，blaNDM-1基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)座元件轉(zhuǎn)移至肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中，再次引起爆發(fā)流行。
　　另外發(fā)現(xiàn)了NDM-1的一個(gè)新的突變體，命名為NDM-14。為了研究新的突變體的特性，首先比較攜帶NDM-1和NDM-

16、14原始菌株的耐藥性差別，同時(shí)構(gòu)建兩種克隆株比較耐藥性差異，最后利用合適的載體，經(jīng)過(guò)兩次純化得到無(wú)標(biāo)簽的NDM蛋白，通過(guò)酶動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)研究酶的各項(xiàng)特征。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與攜帶NDM-1的菌株相比，攜帶NDM-14的菌株耐藥性增強(qiáng)，這種情況在原始啟動(dòng)子存在的情況下尤為明顯。酶動(dòng)力參數(shù)表明，與NDM-1相比，NDM-14對(duì)美羅培南，亞胺培南和氨芐西林的親和力增強(qiáng)。
　　綜上所述，推測(cè):
　　1)我國(guó)產(chǎn)NDM-1菌株是個(gè)獨(dú)立進(jìn)化的過(guò)程