志賀菌流行特性及其對喹諾酮類耐藥機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　 1．了解溫州地區(qū)志賀菌流行的主要種類和血清型別，研究本地區(qū)臨床分離志賀菌的同源性。
　　 2．檢測志賀菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性，為臨床細(xì)菌性痢疾的治療提供依據(jù)。
　　 3．了解志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥現(xiàn)狀，研究志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制，為控制耐藥性的發(fā)展和耐藥菌株的播散提供依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．回顧性研究60株臨床分離志賀菌的血清型分布，了解其臨床流行情況。

2、r>　　 2．選用XbaI限制性核酸內(nèi)切酶對14株福氏志賀茵及標(biāo)準(zhǔn)株沙門菌Brenderup型H9812株進(jìn)行染色體酶切后，采用脈沖場凝膠電泳對志賀菌進(jìn)行分子分型。
　　 3．耐藥性檢測：K-B紙片擴(kuò)散法檢測60株志賀菌對萘啶酸(NAL)、諾氟沙星(NOR)、環(huán)丙沙星(CIP)、左氧氟沙星(LEV)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、亞胺培南(IPM)、美洛培南(MEM)、妥布霉素(TOB)、復(fù)方新諾明(SMZ)、阿莫西

3、林(AML)及替卡西林(TIC)等12種抗菌藥物的敏感性。
　　 4．染色體介導(dǎo)DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅳ基因突變點(diǎn)檢測：用PCR法對60株志賀菌喹諾酮耐藥決定區(qū)(QRDR)相關(guān)基因gyrA、gyrB、parC、parE進(jìn)行檢測，并對其中20株P(guān)CR擴(kuò)增所得的陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序分析。
　　 5．質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因檢測：用PCR法對該60株志賀菌進(jìn)行質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因qnrA、qnrB、qnrS和aac(6’)-

4、Ib的檢測，表型陽性菌株進(jìn)行測序和基因分型。
　　 6．接合轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：以大腸埃希菌J53為受體菌，質(zhì)粒介導(dǎo)喹諾酮類耐藥基因陽性菌株為供體菌，作接合試驗(yàn)，用特異性PCR擴(kuò)增確認(rèn)接合子基因型和耐藥性。
　　 7．主動(dòng)外排機(jī)制檢測：采用瓊脂二倍稀釋法測定60株志賀菌在含與不含外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)條件下對萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星的最低抑菌濃度(MIC)的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1

5、.60株志賀菌中福氏志賀菌41株，占68.3％，血清型分別為IA型7.3％(3/41),IB型2.4％(1/41),IIA型14.6％(6/41),IIB型14.6％(6/41),IVA型7.3％(3/41),IVB型7.3％(3/41),IVC型36.6％(15/41)和X變異型2.4％(1/41)；宋內(nèi)志賀菌16株，占26.7％；痢疾志賀菌2株，占3.3％，血清型為Ⅰ型；鮑氏志賀菌1株占1.7％，血清型為Ⅱ型。
　　 2.1

6、4株福氏志賀菌的脈沖場凝膠電泳結(jié)果經(jīng)Tenover[13]等提出的細(xì)菌同源性判斷標(biāo)準(zhǔn)，將14株菌分為A、B、C、D四型。流行菌株為福氏志賀菌A型，共10株占71.4％(10/14)；散發(fā)菌株為B、C、D型。
　　 3．志賀菌對萘啶酸、復(fù)方新諾明、阿莫西林及替卡西林耐藥率高，耐藥率分別為83.3％、71.7％、86.7及83.3％；不同種類的志賀菌對喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率差異較大，福氏志賀菌對萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星及左氧氟沙

7、星的耐藥率依次為75.6％、19.5％、26.8％及22.0％，而宋內(nèi)志賀菌對上述喹諾酮類抗菌藥物的耐藥率依次為93.4％、0.0％、18.8％及0.0％。
　　 4．對20株P(guān)CR擴(kuò)增所得的陽性產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，結(jié)果顯示志賀菌對喹諾酮類耐藥主要發(fā)生在GyrA基因83位Ser→Leu、87位Asp→Asn突變及parC基因80位Ser→Ile突變。
　　 5.60株志賀菌中qnrS、qnrB陽性菌株各篩選出1株，均為福氏

8、志賀菌，未檢出qnrA和aac(6’)-Ib-cr基因。其中qnrS陽性菌株與大腸埃希菌接合試驗(yàn)成功，并且接合子對多種抗菌藥物的MIC值明顯提高；特異性PCR證實(shí)接合子和供體菌有相同的qnr基因。
　　 6.60株志賀菌中有11株外排泵表型試驗(yàn)陽性，以萘啶酸、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星作為底物，分別有3、5、5、1株菌在5ug/mlCCCP的條件下MIC值降低4倍或4倍以上，其中有18.2％(2/11)的菌株同時(shí)對2種或2種

9、以上的藥物有明顯的外排作用。
　　 結(jié)論：
　　 1．溫州地區(qū)志賀菌感染以福氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌為主，福氏志賀菌中以福氏IvC型為主，其次為血清IIA型和IIB型。來自溫州地區(qū)不同醫(yī)院的14株福氏志賀菌可能主要源于親緣關(guān)系很近的克隆系。
　　 2．志賀菌對喹諾酮類藥物耐藥率高；而不同類型的志賀菌對喹諾酮類藥物的耐藥性差異較大。
　　 3．靶基因突變是喹諾酮類藥物耐藥的主要機(jī)制之一，以DNA旋轉(zhuǎn)酶gyrA基