貝前列素鈉對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用及其機(jī)制的初步探討.pdf

1、足細(xì)胞，即腎小球臟層上皮細(xì)胞，附著在腎小球基底膜的表面，參與腎小球?yàn)V過(guò)屏障的構(gòu)成。足細(xì)胞的損傷和凋亡可直接導(dǎo)致腎小球?yàn)V過(guò)屏障功能受損，對(duì)多種腎臟損傷（包括糖尿病腎臟?。┚兄匾饬x。糖尿病腎臟病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的主要微血管并發(fā)癥之一。抑制足細(xì)胞凋亡對(duì)防治早期糖尿病腎臟病具有重要價(jià)值。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(Renin-angiotensi

2、n-aldosterone system，RAAS)對(duì)糖尿病腎臟病的進(jìn)展有著重要意義。RAAS系統(tǒng)的過(guò)度激活對(duì)足細(xì)胞的凋亡也有重要意義。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）是一種經(jīng)典的多功能細(xì)胞因子，與細(xì)胞增殖、分化及凋亡等多種細(xì)胞活動(dòng)密切相關(guān)，在腎小球纖維化的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用。Schiffer等發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠通過(guò)激活p38MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，而且在TGF-β

3、1轉(zhuǎn)基因小鼠身上可觀察到，TGF-β1過(guò)表達(dá)可激活SMAD(sma-and MAD-related)蛋白家族最終導(dǎo)致小鼠腎小球硬化。絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen active protein kinase，MAPK)是一類絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，主要包括p38MAPK(p38 mitogen active protein kinase，p38MAPK)、c-Jun-N末端激酶(c-jun amino-terminal kinas

4、e，JNK)、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)控的蛋白激酶(Extracellular signal-regulated kinase mediates，ERK)等主要亞型，是介導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)到細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)。p38MAPK信號(hào)通路的激活與DKD的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，BPS可通過(guò)拮抗AngⅡ?qū)Τ銮蛐?dòng)脈的收縮作用進(jìn)而能夠有效減少糖尿病大鼠腎臟的尿白蛋白排泄，并且能夠降低p38MAPK信號(hào)通路活性，抑制TNF-α、TGF-β1、MMP-9等多

5、種炎癥因子的生成，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。Li等也認(rèn)為BPS可能通過(guò)抑制p38MAPK信號(hào)活化來(lái)減少糖尿病心肌細(xì)胞凋亡，具有細(xì)胞保護(hù)作用。
　　因此，本研究以小鼠腎小球足細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察BPS對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠足細(xì)胞凋亡的影響，探討B(tài)PS對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用及可能的機(jī)制。本文具體研究包括以下兩部分:
　　第一部分：貝前列素鈉對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡的影響
　　目的：
　　1.觀察培養(yǎng)的條件永生化小鼠足細(xì)胞在不

6、同環(huán)境下的形態(tài)學(xué)變化，掌握細(xì)胞培養(yǎng)的基本操作過(guò)程。
　　2.觀察不同濃度BPS對(duì)AngⅡ環(huán)境下小鼠腎小球足細(xì)胞MPC5細(xì)胞活性的影響。
　　3.觀察不同濃度BPS對(duì)AngⅡ環(huán)境下小鼠腎小球足細(xì)胞MPC5細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.觀察不同濃度BPS對(duì)AngⅡ環(huán)境下小鼠腎小球足細(xì)胞MPC5細(xì)胞中caspase3蛋白活化表達(dá)的影響。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):實(shí)驗(yàn)細(xì)胞為條件永生化小鼠腎小球足細(xì)胞系(condi

7、tionallyimmortalized mouse podocyte cell line，MPC5)，由南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院腎病中心實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)贈(zèng)。未分化的小鼠足細(xì)胞用含10 U/mL的重組小鼠γ-干擾素（γ-interferon，IFN-γ）的RPMI1640培養(yǎng)基在33℃、5％CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)，每2-3天傳代一次;用不含IFN-γ的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5％ CO2培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化，分化10-14天后可用于實(shí)驗(yàn)。

8、>　　2.細(xì)胞分組:分化成熟的足細(xì)胞采用無(wú)血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h以使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化，平衡后細(xì)胞分組如下:正常對(duì)照組（Control組，純RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)），血管緊張素Ⅱ組（AngⅡ組，AngⅡ濃度為10-7mol/L），AngⅡ聯(lián)合不同濃度的BPS組:AngⅡ濃度為10-7mol/L，BPS濃度分別為1μmol/L(μM)，2μM，5μM。倒置顯微鏡下觀察不同處理組的MPC5細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　3.不同

9、處理組（Control組、AngⅡ組及AngⅡ聯(lián)合不同濃度BPS組）MPC5細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h后用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性。
　　4.不同處理組的MPC5細(xì)胞培養(yǎng)24h，收集1×106個(gè)細(xì)胞，采用AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法染色，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行足細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。
　　5.不同處理組MPC5細(xì)胞培養(yǎng)24h，免疫印跡法檢測(cè)caspase3活化蛋白的表達(dá)。
　　6.采用SPSS19.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)

10、計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3，(x)±s）進(jìn)行描述。采用析因方差分析方法進(jìn)行主效應(yīng)和交互效應(yīng)的分析;計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，各處理組均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-wayANOVA)，任意兩組間比較，當(dāng)滿足方差齊性時(shí)采用LSD法(Least-significantdifference test)，否則，用Welch法校正，采用Dunnett's T3法進(jìn)行組間多重比較。P≤0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)

11、果：
　　不同處理組足細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h后，各處理組足細(xì)胞O.D值均有顯著差異（24h: F=899.009，P＜0.001;48h: F=51.341，P＜0.001）。與Control組比較，24h及48h的AngⅡ組的足細(xì)胞O.D.值均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均＜0.001)。不同濃度BPS組與AngⅡ組比較，24h及48h的足細(xì)胞O.D.值均顯著增加，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（24h1μMBPS: P=0.0

12、13;其余P均＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.BPS能夠有效增強(qiáng)AngⅡ環(huán)境下小鼠足細(xì)胞的活性，對(duì)足細(xì)胞可能有保護(hù)作用。
　　2.BPS能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡，在一定濃度范圍內(nèi)，該效應(yīng)隨著B(niǎo)PS濃度升高而增強(qiáng)。
　　3.BPS能夠有效抑制AngⅡ誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡，可能與減少AngⅡ環(huán)境下caspase3蛋白的活化有關(guān)。
　　第二部分：貝前列素鈉經(jīng)p38MAPK信號(hào)通路抑制血管緊張

13、素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞凋亡
　　目的：
　　1.觀察不同濃度BPS及SB203580對(duì)AngⅡ環(huán)境下小鼠足細(xì)胞TGF-β1蛋白、p38MAPK蛋白磷酸化的表達(dá)的影響。
　　2.觀察p38MAPK抑制劑SB203580對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的影響，探討p38MAPK信號(hào)通路是否參與了BPS對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)。
　　方法：
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)同第一章
　　2.細(xì)胞處理分組:
　　Contr

14、ol組:1640培養(yǎng)基正常培養(yǎng)
　　AngⅡ組:以終濃度為10-7mol/L的AngⅡ孵育足細(xì)胞
　　5μMBPS組:以終濃度為為10-7mol/L的AngⅡ及5μmol/L的BPS共同孵育
　　SB203580抑制(SB)組:以p38MAPK特異抑制劑SB203580預(yù)孵育1h，再以AngⅡ培養(yǎng)MPC5細(xì)胞為SB抑制劑組。
　　3.應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)0min，15min，30min，60min不同時(shí)間點(diǎn)An

15、gⅡ培養(yǎng)條件下小鼠足細(xì)胞系MPC5細(xì)胞p38MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　4.選取AngⅡ環(huán)境下足細(xì)胞p38MAPK磷酸化蛋白增強(qiáng)表達(dá)最顯著的時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用免疫印跡法分別檢測(cè)該時(shí)間點(diǎn)AngⅡ聯(lián)合不同濃度BPS或SB203580對(duì)足細(xì)胞p38MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)。
　　5.分別以CCK-8檢測(cè)24h、48h各不同處理組（包括Control組、AngⅡ組、5μMBPS組及SB組）足細(xì)胞活性。
　　6.用AnnexinⅤ

16、-FITC/PI雙染法染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)24h不同處理組（包括Control組、AngⅡ組、5μMBPS組及SB組）MPC5細(xì)胞的凋亡。
　　7.應(yīng)用免疫印跡法，檢測(cè)各處理組（包括Control組、AngⅡ組、5μMBPS組及SB組）24hMPC5細(xì)胞的caspase3蛋白活化的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.AngⅡ刺激0 min(AngⅡ0')細(xì)胞僅有少量磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)，AngⅡ刺激15 min(An

17、gⅡ15')后p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)顯著增強(qiáng)(P=0.002)，刺激30 min(AngⅡ30')后p38MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)開(kāi)始減弱，刺激60 min(AngⅡ60')磷酸化p38MAPK信號(hào)仍有少量表達(dá)。
　　2.選取AngⅡ刺激15min進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。SB203580能夠有效地阻止AngⅡ誘導(dǎo)足細(xì)胞p38 MAPK磷酸化蛋白的表達(dá)（P=0.001）。與AngⅡ相比，除1μM外，其他濃度BPS培養(yǎng)足細(xì)胞，隨著B(niǎo)PS藥物

18、濃度的增加，足細(xì)胞p38MAPK磷酸化蛋白表達(dá)逐漸減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2μMBPS: P=0.045;5μMBPS:P=0.017）。經(jīng)SB203580抑制p38MAPK磷酸化后，SB組p38MAPK磷酸化表達(dá)較AngⅡ組顯著降低(P=0.001)，與對(duì)照組和5μMBPS組相比，均無(wú)顯著差異（對(duì)照組:P=0.499;5μMBPS: P=0.182）。
　　結(jié)論:
　　BPS能夠有效保護(hù)AngⅡ環(huán)境下的小鼠足細(xì)胞，抑制c