杜仲木脂素對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的:研究杜仲木脂素對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制。
　　方法:采用大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)作為實(shí)驗(yàn)材料，實(shí)驗(yàn)共分為6組:空白對照組、AngⅡ誘導(dǎo)模型組（10-8mol/LAngⅡ）、醛糖還原酶抑制劑依帕司他組（10-8mol/LAngⅡ+20μmol/L依帕司他）以及低濃度（10-8mol/LAngⅡ+20mg/L杜仲木脂素）、中濃度（10-8mol/LAngⅡ+40mg/L杜仲木脂素）和高濃

2、度杜仲木脂素組(10-8mol/LAngⅡ+80mg/L杜仲木脂素)。各組細(xì)胞在含10％胎牛血清培養(yǎng)基中孵育24、36、48h，采用MTT一步法檢測OD490值來評估細(xì)胞數(shù)目;采用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡;采用實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-qPCR)法和蛋白質(zhì)印跡(Westernblot)法檢測細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑-P21、P27、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-Bax、Bcl-2和醛糖還原酶(AR)的mRNA和蛋白表達(dá)水平;

3、采用紫外法檢測細(xì)胞內(nèi)AR的活性。
　　結(jié)果:(1)與對照組相比，模型組在含10％胎牛血清培養(yǎng)基中孵育48h，細(xì)胞數(shù)目顯著增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（1.91±0.06vs1.49±0.08，P＜0.001）;與模型組比較，依帕司他和不同濃度木脂素組細(xì)胞數(shù)目減少，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（1.60±0.04，1.60±0.03，1.58±0.07，1.52±0.04vs1.91±0.06;P值均小于0.001）。提示AngⅡ可促進(jìn)大鼠腎小

4、球系膜細(xì)胞增殖，依帕司他和杜仲木脂素可抑制增殖。
　　(2)與對照組相比，模型組G1期細(xì)胞比例明顯減少（69.2％±0.3％vs73.9％±0.6％，P=0.024），S期細(xì)胞明顯增多（22.4％±1.1％vs12.6％±0.2％，P＜0.001），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組可抑制細(xì)胞進(jìn)入S期，S期細(xì)胞比例明顯下降（11.1％±0.4％，14.0％±0.6％，10.1％±0.2％，7.1％

5、±0.7％vs22.4％±1.1％;P值均小于0.001），四組中高濃度杜仲木脂素組G1期的細(xì)胞比例增大具有統(tǒng)計學(xué)意義（76.4％±1.4％，73.5％±2.5％，76.9％±4.1％，77.6％±0.7％vs69.2％±0.3％;P=0.136,P=0.766,P=0.719,P=0.009)。提示AngⅡ可以誘導(dǎo)靜止細(xì)胞進(jìn)入增殖活躍期，而依帕司他和杜仲木脂素可以阻止系膜細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，將細(xì)胞阻滯在G1期，從而抑制增殖。

6、　　(3)與對照組相比，模型組P21、P27mRNA水平顯著降低(P21:0.31±0.01vs1.00±0.03，P＜0.001;P27:0.30±0.03vs1.00±0.02，P＜0.001)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組和不周濃度杜仲木脂素組P21、P27mRNA水平均顯著高于模型組（P21:1.38±0.07，1.18±0.05，1.34±0.06，1.78±0.11vs1.00±0.03，P值均小于0.00

7、1;P27:1.45±0.05，1.17±0.05，1.50±0.06，2.10±0.03vs1.00±0.02，P值均小、于0.001），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　與mRNA表達(dá)相似，模型組P21、P27蛋白水平顯著降低(P21:0.52±0.06vs1.00±0.14，P=0.004;P27:0.72±0.02vs1.00±0.12，P＜0.001)，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組P21

8、、P27蛋白水平均顯著高于模型組（P21:3.21±0.12，2.23±0.15，3.23±0.23，5.24±0.22vs0.52±0.06，P值均小于0.001;P27:2.36±0.04，1.96±0.06，2.24±0.06，3.14±0.06vs0.72±0.02，P值均小于0.001），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。提示周期素依賴激酶抑制因子P21和P27在依帕司他和杜仲木脂素調(diào)節(jié)HBZY-1細(xì)胞周期過程中發(fā)揮重要作用。
　　

9、(4)與對照組相比，模型組細(xì)胞的凋亡率顯著高于對照組（10.5％±0.3％vs8.7％±0.3％，P=0.001），差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組凋亡率顯著增高（17.9％±0.6％，16.1％±0.3％，18.7％±0.2％，22.5％±0.9％vs10.5％±0.3％;P值均小于0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且杜仲木脂素濃度越大，凋亡率越高。提示依帕司他和杜仲木脂素可通過促使細(xì)胞凋亡的方式消

10、除活化增殖的HBZY-1。
　　(5)與對照組相比，模型組Bax、Bcl-2mRNA水平顯著增高(Bax:1.70±0.02vs1.00±0.08，P＜0.001;Bcl-2:1.34±0.06vs1.00±0.03，P＜0.001)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與AngⅡ組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組的BaxmRNA水平均顯著高于模型組（2.25±0.02，1.89±0.02，2.30±0.01，3.29±0.10vs1.00

11、±0.08;P＜0.001，P=0.001，P＜0.001，P＜0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且杜仲木脂素濃度越大，BaxmRNA水平越高;而依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組的Bcl-2mRNA水平與模型組無統(tǒng)計學(xué)差異(1.43±0.02，1.31±0.05，1.34±0.07，1.28±0.04vs1.34±0.06;P=0.056,P=0.435,P=0.942，P=0.167)。
　　與mRNA表達(dá)相似，模型組Bax、B

12、cl-2蛋白水平著增高(Bax:1.81±0.04vs1.00±0.05，P＜0.001;Bcl-2:2.24±0.10vs1.00±0.10，P＜0.001）差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與AngⅡ組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組的Bax蛋白水平均顯著高于模型組（2.29±0.05，2.13±0.04，2.39±0.04，3.15±0.06vs1.81±0.04;P值均小于0.001），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，且杜仲木脂素濃度越大，Bax蛋

13、白水平越高;而依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組的Bcl-2蛋白水平與模型組無統(tǒng)計學(xué)差異（2.21±0.09，2.31±0.12，2.28±0.12，2.29±0.02vs2.24±0.10;P=0.769，P=0.365，P=0.617，P=0.481）。提示細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax和Bcl-2的表達(dá)在依帕司他和杜仲木脂素調(diào)節(jié)HBZY-1細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。
　　(6)與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)AR活性明顯增加(0.19±0

14、.03vs0.14±0.01，P=0.012)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組和不同濃度杜仲木脂素組細(xì)胞內(nèi)AR活性顯著下降（0.11±0.01，0.11±0.01，0.11±0.01，0.12±0.03vs0.19±0.03;P=0.001，P＜0.001，P=0.001，P=0.002），但四組之間并無明顯差異。提示活化的AR可能會誘導(dǎo)HBZY-1的增殖，抑制AR的活性可以抑制HBZY-1的增殖。
　　(7)與對照

15、組相比，模型組能夠顯著增加AR(1.35±0.04vs1.00±0.11，P＜0.001)mRNA水平，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組的ARmRNA水平較模型組增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（3.78±0.13vs1.35±0.04，P＜0.001）;不同濃度杜仲木脂素均使ARmRNA水平低于模型組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（1.08±0.03，0.98±0.09，0.86±0.08vs1.35±0.04;P值均小于0.001）。

16、r>　　與mRNA表達(dá)相似，模型組AR蛋白水平顯著升高（2.02±0.08vs1.00±0.08，P=0.003），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;與模型組相比，依帕司他組的AR蛋白水平較模型組顯著增加(3.13±0.24vs2.02±0.08，P=0.001)，不同濃度杜仲木脂素均使AR蛋白水平顯著低于模型組（0.52±0.17，0.66±0.22，0.45±0.23vs2.02±0.08;P值均小于0.001），但不同杜仲木脂素濃度組間差異無統(tǒng)