家蠶性別決定途徑上游關(guān)鍵基因的鑒定與功能研究.pdf

1、家蠶性別決定既是基本的生物學(xué)問題，也與蠶絲產(chǎn)業(yè)密切相關(guān)，長期以來受到人們的高度關(guān)注。家蠶為雌雜合型，經(jīng)典遺傳學(xué)研究表明在W染色體上的一個強(qiáng)雌性決定因子(Fem)決定個體為雌性，但是到目前為止Fem還沒有被鑒定出來。2001年Ohbayashi等克隆了果蠅性別決定級聯(lián)末端基因dsx在家蠶中的同源體Bmdsx，發(fā)現(xiàn)其與果蠅dsx相似：Bmdsx的初級轉(zhuǎn)錄物在雌性和雄性中也是通過選擇性拼接產(chǎn)生性別特異性成熟mRNA來控制家蠶性別的末端分化。但

2、是Bmdsx基因前體mRNA選擇性拼接的調(diào)控機(jī)制與果蠅dsx不同，果蠅中默認(rèn)的拼接方式為雄特異性的，在雌性中TRA/TRA—2激活了雌特異性拼接，而家蠶中Bmdsx默認(rèn)的拼接方式為雌特異性的，在雄性中由于受到某一阻遏機(jī)制的作用使得Bmdsx前體mRNA的第3和第4外顯子的拼接受到抑制。遺憾的是，到目前為止對于從上游的Fem到下游Bmdsx之間的性別調(diào)控途徑仍然不清楚。為了弄清家蠶Bmdsx之上的性別調(diào)控途徑，本文利用基因芯片分析了早期胚

3、胎雌雄差異表達(dá)基因，其次通過蛋白與RNA結(jié)合及質(zhì)譜對調(diào)控Bmdsx拼接的因子進(jìn)行了鑒定，并對可能的Fem候選基因進(jìn)行了克隆及轉(zhuǎn)基因研究。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴家蠶的性別決定于胚胎發(fā)育的早期，理論上，參與家蠶性別決定的基因在胚胎發(fā)育的早期應(yīng)該有雌雄表達(dá)上的差異。為了尋找參與家蠶性別決定的基因，我們利用基因芯片來尋找在早期胚胎有雌雄表達(dá)差異的基因。以胚胎期根據(jù)卵色就能分開雌雄的限性白卵品種為材料，取受精后48小時、60小

4、時、72小時、96小時4個時間點的雌雄胚胎，以受精后4小時胚胎為對照進(jìn)行芯片雜交。其結(jié)果，共篩選出4049個至少在一個時間點有雌雄表達(dá)差異的基因。GO分類表明，這些基因的功能主要為催化功能，核酸結(jié)合，蛋白結(jié)合以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能，參與代謝過程，發(fā)育過程，生物過程的調(diào)控以及色素形成。其中有2432個差異表達(dá)基因是由于受精后合子基因在雌雄中的轉(zhuǎn)錄差異而造成的。1062個基因是由于母體轉(zhuǎn)錄物在雌雄中降解程度的不同而導(dǎo)致的差異。以受精后4小時為參照

5、，分析發(fā)現(xiàn)，在受精后48小時、60小時、72小時和96小時，每一個時間點相對于受精后4小時上調(diào)表達(dá)的基因總比下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)目多，這說明早期胚胎雌雄之間的差異更多的是由于合子基因在雌雄中轉(zhuǎn)錄水平的差異而造成的。將這些相對于受精后4小時上調(diào)表達(dá)的雌雄差異表達(dá)基因進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)這些基因在雌雄中的表達(dá)模式不同，在雌性中的48小時形成一個峰，表達(dá)量從48小時到72小時逐漸下降，到96小時又上升；而在雄性中絕大多數(shù)基因是從48小時到72小時逐漸上

6、升，到96小時又下降。這可能與胚胎發(fā)育的早期雌雄蠶卵的著色不同有關(guān)。
　　 ⑵通過poly(U)序列與雌性和雄性核抽提物的gel—shift實驗，結(jié)果表明，BmSXL—PB并沒有結(jié)合到Bmdsx的第3內(nèi)含子的3’拼接位點處的poly(U)序列上。同時以限性白卵品種為材料，通過RT—PCR檢測表明Bmsxl—PB在雌雄胚胎中表達(dá)量及其微弱，并且沒有雌雄表達(dá)差異。這些結(jié)果說明BmSXL—PB并不是調(diào)控Bmdsx前體mRNA雄特異性拼

7、接的的關(guān)鍵性拼接阻遏因子。RBP1是參與果蠅性別決定基因dsx前體mRNA選擇性拼接的重要拼接因子。本研究克隆了rbp1在家蠶中的同源體Bmrbp1基因。發(fā)現(xiàn)Bmrbp1前體mRNA通過選擇性拼接產(chǎn)生四種成熟mRNA，分別命名為Bmrbp1—PA，Bmrbp1—PB，Bmrbp1—PC和Bmrbp1—PD，分別編碼142 aa，159 aa，91 aa和117 aa。其中BmRBP1—PA和BmRBP1—PD具有一個N末端RRM結(jié)構(gòu)域和

8、一個C末端RS結(jié)構(gòu)域，而BmRBP1—PB和BmRBP1—PC只具有一個N末端RRM結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對表明BmRBP1—PA與在其它昆蟲中的同源體保守性很高，并與其它SR家族蛋白在RRM結(jié)構(gòu)域高度保守。RT—PCR結(jié)果表明Smrbp1—PA在所檢測的不同組織和各個發(fā)育時期均有高量表達(dá)，Bmrbp1—PB在所檢測的這些組織和時期表達(dá)很弱，并且Bmrbp1—PA和Bmrbp1—PB在雌雄中無明顯的表達(dá)差異，而Bmrbp1—PC和Bmrb

9、p1—PD則很難檢測到。
　　 ⑶Suzuki等的研究表明Bmdsx第4外顯子對Bmdsx前體mRNA的雄特異性拼接起著決定性的作用，并且在該外顯子上存在3個關(guān)鍵性的順式調(diào)控元件，發(fā)現(xiàn)BmPSI能夠結(jié)合到順式調(diào)控元件CE1上調(diào)控Bmdsx的拼接。為了尋找其它調(diào)控Bmdsx雄特異性拼接的因子，我們在Bmdsx第4外顯子上共設(shè)計了5個RNA探針做UV cross—linking及gel—shift實驗，發(fā)現(xiàn)有核蛋白結(jié)合在探針CE1+

10、6上，UV cross—linking實驗表明結(jié)合的蛋白大約為28 kD，將結(jié)合的蛋白帶從膠上切下，通過LC—MS/MS對結(jié)合的蛋白進(jìn)行鑒定，根據(jù)質(zhì)譜鑒定的結(jié)果克隆出該基因完整的編碼區(qū)，結(jié)果表明該基因編碼256 aa，為果蠅核糖核蛋白Hrp48在家蠶中的同源體，命名為BmHrp28，大小為28.2 kD，在N端含有兩個RRM結(jié)構(gòu)域，C端含有一個甘氨酸富集結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列比對表明BmHrp28與哺乳動物中的hnRNP A1以及果蠅Hrp

11、48在RRM結(jié)構(gòu)域高度保守。將BmHrp28基因編碼區(qū)用pET50b載體進(jìn)行原核表達(dá)并進(jìn)行純化，gel—shift和UV cross—linking實驗表明純化的BmHrp28蛋白能夠特異地結(jié)合到探針CE1+6上。這些結(jié)果表明BmHrp28能特異結(jié)合到Bmdsx的第4外顯子上，應(yīng)該是一個參與家蠶Bmdsx前體mRNA雄特異性拼接的拼接因子。
　　 ⑷以BmWZF1為起點，向BmWZF1基因的3’端延伸，克隆了位于W染色體上BmW

12、ZF1的3’端的另外一個鋅指蛋白基因BmWZF2。發(fā)現(xiàn)該基因編碼363 aa，含有6個C2H2結(jié)構(gòu)域。通常C2H2結(jié)構(gòu)域具有結(jié)合DNA的功能，將BmWZF2蛋白在NCBI進(jìn)行同源性檢索發(fā)現(xiàn)與其他物種的轉(zhuǎn)錄因子相似性很高。推測該基因編碼的蛋白為一個轉(zhuǎn)錄因子，可能對下游靶基因起到轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用。將BmWZF1和BmWZF2的核苷酸序列與家蠶基因組序列進(jìn)行BLASTN比對，發(fā)現(xiàn)兩個基因在常染色體均有兩個序列高度一致的拷貝，其中BmWZF1在常

13、染色體上的兩個拷貝命名為BmAZF1a和BmAZF1b。BmWZF2在常染色體上的兩個拷貝命名為BmAZF2a和BmAZF2b。發(fā)現(xiàn)BmAZF1a，BmAZF16，BmAZF2a和BmAZF2b都位于家蠶第25連鎖群，并且依次排列成一串，其中BmAZF1a和BmAZF2a的轉(zhuǎn)錄方向相對。
　　 ⑸經(jīng)典遺傳學(xué)的研究表明家蠶的性別由位于W染色體上一個推測的Fem基因決定，但Fem基因的具體分子形式一直沒鑒定出來。Suzuki等的研究