人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞來源的雪旺氏細(xì)胞樣細(xì)胞移植在皮瓣神經(jīng)再生中的作用.pdf

1、目的：
　　通過體外對人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic membrane mesenchymal stem cells，hAMSCs）的分離、培養(yǎng)及鑒定，并在體外誘導(dǎo)分化為雪旺氏細(xì)胞樣細(xì)胞（induce Schwann cells，iSCs），分別觀察兩種細(xì)胞移植對皮瓣神經(jīng)再生的影響。
　　方法：
　　1）產(chǎn)婦知情同意后采集足月剖宮產(chǎn)羊膜，采用胰蛋白酶/膠原酶二步消化法分離提取hAMSCs，接種48h后

2、予以細(xì)胞換液以去除人羊膜上皮細(xì)胞，并按同樣方法傳1～2代，通過差速貼壁方法純化hAMSCs。流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞免疫熒光鑒定hAMSCs。
　　2）取P3代生長至第6d的hAMSCs在體外誘導(dǎo)分化為iSCs，誘導(dǎo)分化后，分別取iSCs和P3代hAMSCs做免疫熒光染色檢測兩組細(xì)胞S-100、P75和GFAP的表達(dá)；Western blot檢測兩組細(xì)胞S-100、P75和GFAP蛋白的表達(dá)；實(shí)時熒光定量PCR檢測兩組細(xì)胞S-100、P7

3、5和GFAP基因表達(dá)；ELISA檢測hAMSCs培養(yǎng)6d以及hAMSCs誘導(dǎo)后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF濃度。
　　3）建立大鼠腹壁失神經(jīng)支配穿支皮瓣模型，分為三組：即hAMSCs移植組（A組）、iSCs移植組（B組）及穿支皮瓣模型對照組（C組），每組25只。取增殖期的P3代hAMSCs和誘導(dǎo)后的iSCs，分別于每只大鼠皮瓣標(biāo)記處皮下多點(diǎn)注射1×106個相應(yīng)細(xì)胞，C組注射PBS。免疫熒

4、光染色觀察神經(jīng)再生，分別于細(xì)胞移植后2d、5d、7d、9d、14d各組取5只動物。
　　結(jié)果：
　　1）本實(shí)驗(yàn)中采用胰蛋白酶/膠原酶雙酶化法可以獲得大量增殖穩(wěn)定的hAMSCs，并利用差速貼壁法可去除大量的人羊膜上皮細(xì)胞，獲得純度較高的hAMSCs。hAMSCs原代培養(yǎng)48h后可見細(xì)胞貼壁生長，5～6d細(xì)胞密度可達(dá)到80％～90%。流式細(xì)胞鑒定：CD90（99.61%）、CD44（99.64%）、CD73（99.82%）、CD

5、105（91.84%）呈陽性， CD34、CD11b、CD19、CD45、HLA-DR呈陰性（0.12%）。細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示hAMSCs高表達(dá)波形蛋白，未表達(dá)CK19。
　　2）免疫熒光染色結(jié)果顯示iSCs組S-100、P75和GFAP的表達(dá)量明顯高于hAMSCs組（P＜0.05）；Western blot結(jié)果顯示iSCs組S-100、P75和GFAP蛋白表達(dá)量明顯高于hAMSCs組（P＜0.05）；qPCR結(jié)果顯示iSC

6、s組S-100、P75和GFAP的基因表達(dá)量明顯高于hAMSCs組（P＜0.05）；ELISA分別檢測hAMSCs培養(yǎng)6d以及hAMSCs誘導(dǎo)后1d、4d、7d、10d、13d、16d、19d上清液中BDNF和NGF濃度：可見hAMSCs培養(yǎng)6天后BDNF和NGF均有表達(dá)，加入誘導(dǎo)液1后，BDNF和NGF表達(dá)量明顯降低，隨著誘導(dǎo)液2及誘導(dǎo)液3的依次添加，BDNF和NGF的表達(dá)量逐漸升高，且濃度明顯高于hAMSCs培養(yǎng)6d組，說明在誘導(dǎo)分

7、化過程中分泌了大量的BDNF和NGF，提供了潛在的促進(jìn)神經(jīng)再生的營養(yǎng)支持。
　　3）細(xì)胞移植后第2d、5d、7d、9d、14d分別行皮瓣組織免疫熒光染色，iSCs移植組再生神經(jīng)纖維數(shù)量和直徑均高于hAMSCs移植組。
　　結(jié)論：
　　1）胰蛋白酶/膠原酶雙酶消化法可獲得大量的hAMSCs，通過胰酶消化和差速貼壁法，可獲得高純度的hAMSCs；
　　2）分別通過免疫熒光、Western blot、qPCR及ELIS