二甲雙胍局部注射緩解神經(jīng)病理性疼痛的研究.pdf

1、背景:神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain,NPP),是由軀體感覺系統(tǒng)疾病或損傷引起的慢性疼痛綜合征。其病因復(fù)雜,是一種極其復(fù)雜的臨床綜合征,對(duì)醫(yī)藥工作者構(gòu)成了巨大的挑戰(zhàn)。目前,臨床上常用的治療藥物包括抗抑郁藥、抗癲癇藥、局部麻醉藥,阿片類鎮(zhèn)痛藥以及非甾體類抗炎藥物等,但治療效果很不理想。因此,探索神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機(jī)制,尋找新的治療靶點(diǎn),迫在眉睫。
　　目前,關(guān)于神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制有許多研究:神經(jīng)炎癥成為解釋

2、該綜合征的主流學(xué)說,神經(jīng)炎癥對(duì)于疼痛中樞敏化的調(diào)節(jié)也成為疼痛領(lǐng)域中的熱點(diǎn)問題。令人惋惜的是,臨床試驗(yàn)結(jié)果證明,無論是膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑還是CCR2受體抑制劑,均未能表現(xiàn)出任何顯著的鎮(zhèn)痛效果。因此,與基礎(chǔ)研究的導(dǎo)向不同,臨床試驗(yàn)結(jié)果提示利用神經(jīng)炎癥抑制來鎮(zhèn)痛的思路可能并不可行。因而要攻克這一疾病,要求我們另辟蹊徑,尋求別的解決思路。
　　巨噬細(xì)胞是一種非常重要的免疫細(xì)胞,主要通過固有免疫保護(hù)宿主并且在炎癥過程中對(duì)死亡細(xì)胞進(jìn)行吞噬性清除。

3、巨噬細(xì)胞至少可以分為兩種活化類型,相應(yīng)地M1極化抑制細(xì)胞增殖并產(chǎn)生組織損傷和炎癥,而M2型極化則發(fā)揮抗炎和組織修復(fù)功能。且巨噬細(xì)胞尤其是M2亞型,在傷口愈合和神經(jīng)再生中扮演著非常重要的角色。巨噬細(xì)胞存在著分型的轉(zhuǎn)化,即在M1-M2狀態(tài)之間變化。通常認(rèn)為,在損傷修復(fù)的不同階段,巨噬細(xì)胞會(huì)經(jīng)歷動(dòng)態(tài)的變化過程:M1型極化巨噬細(xì)胞對(duì)于損傷后炎癥反應(yīng)的觸發(fā)十分關(guān)鍵,而轉(zhuǎn)換為M2極化型則對(duì)于炎癥消除和受損組織的再生至關(guān)重要。
　　另外,包含單

4、核/巨噬細(xì)胞在內(nèi)的免疫細(xì)胞中也含有內(nèi)源性阿片肽。基于巨噬細(xì)胞以上的兩點(diǎn)特性,即:一、該細(xì)胞至少存在兩種功能狀態(tài),在M1型時(shí)發(fā)揮促炎、免疫吞噬的作用,而在M2狀態(tài)下卻具有抗炎并促進(jìn)組織修復(fù)的作用;二、在特定狀態(tài)下,這類細(xì)胞可以釋放強(qiáng)效鎮(zhèn)痛的內(nèi)源性阿片肽;我們推測(cè)巨噬細(xì)胞尤其M2型巨噬細(xì)胞對(duì)于NPP的治療有著無限潛力?；谝陨?我們初步形成科學(xué)假說:即通過“馴養(yǎng)”巨噬細(xì)胞,釋放更多的內(nèi)啡肽,從而同時(shí)發(fā)揮促修復(fù)和鎮(zhèn)痛的作用,緩解頑固性神經(jīng)病理

5、性疼痛。
　　目的:本研究我們?cè)噲D通過在局部（神經(jīng)損傷部位）激動(dòng)AMPK,誘發(fā)巨噬細(xì)胞釋放內(nèi)啡肽來治療神經(jīng)病理性疼痛,并探討其中可能的具體細(xì)胞和分子機(jī)制。
　　方法:(1)利用CCI整體動(dòng)物模型,考察神經(jīng)病理性疼痛中,二甲雙胍局部注射能否對(duì)經(jīng)典的疼痛行為學(xué)指標(biāo)——機(jī)械性縮足反射閾值產(chǎn)生影響。(2)選取巨噬細(xì)胞殺傷劑氯膦酸鹽脂質(zhì)體,阿片受體拮抗劑納洛酮和μ型阿片受體抑制劑CTAP以及AMPK抑制劑Compound C作為工具藥

6、物預(yù)處理,對(duì)正常大鼠進(jìn)行局部神經(jīng)周注射,考察對(duì)二甲雙胍鎮(zhèn)痛作用的影響,并探索其可能的分子機(jī)制。(3)在骨髓來源的原代巨噬細(xì)胞BMDM完成全部的細(xì)胞實(shí)驗(yàn),WB方法檢測(cè)p-AMPK,p-p38等蛋白的水平,Elisa試劑盒測(cè)定BMDM細(xì)胞上清中的β-內(nèi)啡肽含量。(4)使用免疫熒光的方法檢測(cè)分子機(jī)制。(5) Co-IP免疫共沉淀的方法檢測(cè)BMDM中AMPK-TAB1-p38復(fù)合物的形成。
　　結(jié)果:(1)二甲雙胍局部神經(jīng)周注射可以顯著改

7、善大鼠CCI模型引起的神經(jīng)病理性疼痛。(2)巨噬細(xì)胞殺傷劑氯膦酸鹽脂質(zhì)體,阿片受體拮抗劑納洛酮和μ型阿片受體抑制劑CTAP以及AMPK抑制劑Compound C(CC)都能明顯抑制二甲雙胍產(chǎn)生的鎮(zhèn)痛作用。(3)細(xì)胞Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示,二甲雙胍刺激后BMDM中的p38MAPK和AMPK磷酸化水平明顯上升;BMDM上清中β-內(nèi)啡肽的含量顯著上升,而p38 MAPK抑制劑SB203580和AMPK抑制劑CC都能取消這種上升。(4