CTGF-整合素β1受體信號途徑在PASMC增殖、遷移和細胞外基質(zhì)沉積中的作用.pdf

1、目的:1.探討整合素β1受體在CTGF促進PASMC增殖、遷移、細胞骨架變化和細胞外基質(zhì)分泌中的作用機制。2.初步探討CTGF-整合素β1受體信號途徑在肺動脈高壓肺血管重構(gòu)中的作用。
　　 方法:1.分離并培養(yǎng)SD大鼠肺動脈中膜平滑肌細胞,實驗使用3～7代細胞；2.加入CTGF和不同濃度整合素β1抗體共同孵育24h、48h、72h、96h和120h,采用WST-1檢測整合素β1抗體對CTGF促進PASMC增殖的影響；3.在無刺激

2、因子、CTGF(50ng／ml)和CTGF(50ng／ml)+整合素β1抗體(15mg／L)孵育PASMC24h,采用Transwell小室檢測整合素β1抗體對CTGF促進PASMC遷移的影響；4.在無刺激因子、CTGF(50ng／ml)和CTGF(50ng／ml)+整合素β1抗體(15mg／L)孵育PASMC12h和24h,采用考馬斯亮藍R250染色和激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架改變情況；5.在無刺激因子、CTGF(50ng／ml)和

3、CTGF(50ng／ml)+整合素β1抗體(15mg／L)孵育PASMC72h,采用RT-PCR檢測整合素β1抗體對CTGF促進CollagenⅠ-α1、CollagenⅢ-α1、Fibronectin-1 mRNA表達的影響；并采用蛋白質(zhì)印跡檢測整合素β1抗體對CTGF促進PASMC中Ⅲ型膠原蛋白的表達及細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2(ERK1／2)的磷酸化水平,并研究整合素β1抗體對ERK1／2信號通路的影響。
　　 結(jié)果:1.用

4、CTGF(50ng／ml)和整合素β1抗體(0、5、10、15 mg／L)同時孵育PASMC24h、48h、72h、96h和120h,WST-1檢測結(jié)果表明,整合素β1抗體對CTGF促進PASMC增殖有明顯抑制作用(P<0.01),并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性,其中整合素β1抗體(15mg／L)在72h抑制率最高。2.Transwell小室檢測結(jié)果顯示,以整合素β1抗體(15 mg／L)封閉PASMC24h后,CTGF刺激的細胞遷移受到明顯抑

5、制(P<0.01)。3.考馬斯亮藍R250染色觀察細胞骨架變化結(jié)果發(fā)現(xiàn),24h時,各組之間細胞骨架變化不明顯；在12h時與對照組比較,CTGF組能短暫改變細胞形態(tài)；使用整合素β1抗體后,CTGF所引起的細胞形態(tài)變化不明顯。同時采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察胞內(nèi)FAK的變化結(jié)果發(fā)現(xiàn),12h時,細胞形態(tài)及胞質(zhì)內(nèi)綠色熒光變化不明顯。而CTGF作用PASMCs24h可見細胞形態(tài)縮小,胞質(zhì)綠色熒光(FAK)減弱,分散。但整合素β1抗體作用24h后細

6、胞形態(tài)與正常組相近。4.RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與對照組比較,CTGF顯著促進Ⅰ型膠原-α1、Ⅲ型膠原-β1和纖維連接蛋白-1mRNA表達(P<0.05)；使用整合素β1抗體后與CTGF組比較三種基因mRNA表達均減少(P<0.05)。5.蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明,與對照組比較CTGF明顯促進Ⅲ型膠原蛋白表達；使用整合素β1抗體后Ⅲ型膠原蛋白表達較CTGF組減少(P<0.05),但較對照組表達增加；且整合素β1(15mg／L)抗體能明顯抑制

7、CTGF誘導大鼠。PASMCs中ERK1／2磷酸化的水平,p-ERK1／2與ERK1／2比值降低(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.整合素β1介導了CTGF誘導的PASMC增殖、遷移和細胞骨架變化。2.整合素β1可介導外源性CTGF促進PASMCⅠ型膠原-α1、Ⅲ型膠原-α1、纖維連接蛋白-1 mRNA表達,以及介導CTGF促進Ⅲ型膠原蛋白表達。4.整合素β1介導CTGF誘導的PASMC增殖和遷移可能與ERK1／2信號通路有關(guān)。