大腸埃希菌質(zhì)粒編碼基因的克隆與功能研究.pdf

1、目的：
　　 篩選大腸埃希菌耐藥質(zhì)粒編碼的未知功能的新基因，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析、克隆、原核細(xì)胞表達(dá)和初步的功能研究，為今后大規(guī)模功能未知基因的分子遺傳學(xué)研究建立研究平臺。
　　 方法：
　　 本實(shí)驗(yàn)對來自不同年份的320株多重耐藥大腸埃希菌質(zhì)粒DNA進(jìn)行高通量測序，通過一系列的生物信息學(xué)工具篩選出耐藥質(zhì)粒編碼的功能未知基因，運(yùn)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增出新基因的開放閱讀框(ORF)，克隆入pUC19-

2、T載體，轉(zhuǎn)化于E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，進(jìn)行酶切和測序鑒定。將測序驗(yàn)證成功的陽性質(zhì)粒雙酶切后與表達(dá)載體pET-28a連接，轉(zhuǎn)化于感受態(tài)細(xì)胞E.coliBL21中，用加有抗菌藥物的瓊脂平板進(jìn)行重組菌篩選。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，并采用SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達(dá)情況。用瓊脂平皿稀釋法對對照菌與重組菌同時進(jìn)行MIC測定。采用超聲破碎法進(jìn)行重組菌粗酶液的大量提取，His親和層析純化粗酶，等電聚焦電泳測定其pI

3、。測序結(jié)果進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸序列比對和保守結(jié)構(gòu)域、信號肽、跨膜區(qū)、疏水性等生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)果：
　　 1高通量測序結(jié)果：第一批數(shù)據(jù)中包含160株多重耐藥大腸埃希菌(E1)的Solexareads總數(shù)為11，077，768:可以定位到功能未知基因的序列(mappedreads)為9933，占總reads的比例約為0.09％，編碼新的未知功能的基因有532個。第二批數(shù)據(jù)包括160株多重耐藥大腸埃希菌(E2)的Sole

4、xareads總數(shù)為9，377，792;mappedreads為11906，占總reads的比例約為0.13％，編碼新的未知功能的基因有516個。
　　 2對其中的部分功能未知基因進(jìn)行克隆，結(jié)果初步構(gòu)建成功50個新基因的表達(dá)載體。
　　 3細(xì)菌裂解液的SDS-PAGE電泳結(jié)果表明pET28a∷bqy09201等27株攜帶表達(dá)載體重組菌經(jīng)誘導(dǎo)后可以高效表達(dá)目的蛋白，pET28a∷bqy03052等21株重組菌表達(dá)的蛋白與對

5、照菌沒有顯著差異，pET28a∷bqy022和pET28a∷bqy09066重組菌表達(dá)的蛋白甚至比對照菌表達(dá)的條帶更少。
　　 4MIC結(jié)果表明：跟對照菌相比，絕大多數(shù)重組菌對抗菌藥物的耐藥性沒有顯著差異。有3株重組菌的耐藥性較對照菌明顯增加：pET∷bqy09232/E.coli重組菌對氨芐西林、頭孢呋辛、頭孢唑啉有顯著耐藥性差異；pET∷bqy09201/E.coli重組菌對氨芐西林、頭孢呋辛、四環(huán)素、紅霉素有耐藥性差異；p

6、ET::bqy021/E.coli重組菌對頭孢替安有耐藥性差異。有4株重組菌的耐藥性較對照菌反而明顯下降(pET∷bqy09235/E.coli、pET∷bqy09009/E.coli、pET∷bqy03053/E.coli、pET∷bqy017/E.coli)。
　　 5測序分析驗(yàn)證了bqy09201基因的開放讀碼框包含1182bp，GenBank收錄號為JF437869，編碼393個氨基酸，與網(wǎng)上公布的編碼區(qū)相符合，經(jīng)克隆、

7、表達(dá)、提取蛋白純化后，等電點(diǎn)測定為4.7，相對分子質(zhì)量為58kDa，與理論預(yù)期的分子量大小相符。
　　 6對Bqy09201蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性分析表明該蛋白與美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種和擬態(tài)弧菌的相應(yīng)基因具有較高的同源性，保守結(jié)構(gòu)域?yàn)镵orB和未知功能的ParBcsuperfamily，為非跨膜蛋白，不含信號肽，具有一些化學(xué)修飾位點(diǎn)。其氨基酸含有1個N糖基化位點(diǎn)，1個依賴cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，4個蛋白激酶C磷

8、酸化位點(diǎn)，7個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，5個N端豆蔻酰化位點(diǎn)，1個酰胺化位點(diǎn)。該蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 結(jié)論：
　　 1新一代高通量測序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)工具對于混合樣本中新編碼基因的篩選是一種極為有效的方法。
　　 2成功克隆了50個功能未知基因，其中3個基因與細(xì)菌的耐藥性相關(guān)。
　　 3借助于生物信息學(xué)方法了解了bqy09201基因可能的性質(zhì)和功能，通過研究該基因的蛋白表達(dá)、提取純化、分子量測定、等