AHL-SdiA抑制大腸埃希菌質粒轉移.pdf

1、目的:
　　質粒轉移是細菌傳播耐藥基因的重要途徑。質粒(plasmid)是的環(huán)形DNA，它不僅獨立于細菌染色體，而且能自主復制。部分質粒具有轉移性，并能攜帶抗生素耐藥基因。廣泛宿主質粒能穿梭于細菌間，因此質粒被視為傳播耐藥的關鍵媒介。質粒水平轉移的主要途徑是細菌的接合作用。接合作用(conjugation)是細菌借助性菌毛相互溝通、傳受DNA的過程。因此，細菌接合作用被視為傳播抗生素耐藥基因的重要途徑。AHL是細菌群體感應系統(tǒng)的信

2、號分子。群體感應(quorum sensing，QS)是細菌感知群體數(shù)量變化，并調整群體行為的調控系統(tǒng)。其中，脂肪酰基高絲氨酸內(nèi)酯(acylhomoserine lactones，AHL)是革蘭陰性菌QS系統(tǒng)的信號分子，它通過結合LuxR類受體蛋白，實現(xiàn)調控基因表達。
　　蛋白SdiA是QS系統(tǒng)的受體蛋白，同時也是重要的轉錄因子。蛋白SdiA存在于大腸埃希菌中，能感知并結合其他細菌分泌的AHL。蛋白SdiA擁有DNA結合域，它能結

3、合基因的啟動子，以調控基因表達。因此，QS系統(tǒng)通過AHL-SdiA調控基因表達。
　　一般認為，質粒轉移的調控是由質粒與宿主共同調控的過程，而受體菌參與接合調控則少有報道。本文推測，受體菌能通過QS系統(tǒng)調控質粒轉移:受體菌分泌AHL，通過與宿主的蛋白SdiA結合，兩者形成復合物，以調控接合相關基因traⅠ。其中，蛋白TraⅠ能結合質粒復制起始點oriT，參與質粒的復制及轉移全過程，直接調控細菌接合作用。
　　因此，本文探究A

4、HL-SdiA與基因traⅠ的調控關系。另外，本文發(fā)現(xiàn)蛋白SdiA對sRNA的調控作用，展望后續(xù)研究AHL-SdiA-sRNA對細菌接合作用的調控機制。
　　方法:
　　本實驗采用大腸埃希菌SM10λπ作為質粒供體菌。該菌染色體被整合了質粒轉移的調控元件(包含基因traⅠ)，并含有轉移性質粒pUC24T。質粒pUC24T具慶大霉素(Gm)抗性，作為候選實驗的篩選標記。受體菌則選用銅綠假單胞菌PAO1。PAO1基因lasI、基

5、因rh1Ⅰ分別調控3-oxo-C12-HSL、C4-HSL的催化合成，后兩者為PAO1最主要的AHL。
　　實驗主要通過構建接合模型、運用熒光定量PCR(qPCR)檢測基因表達量以及啟動子報告質粒來驗證實驗假設。
　　構建接合模型。分別將供、受體菌培養(yǎng)至0.5麥氏濁度單位(MCF)。利用尿液分析儀測細菌濃度，并調配菌液濃度至1.0×107CFU/mL。供、受體菌各取100μ L，37℃混合培養(yǎng)6h。篩選合子并計數(shù)，換算接合頻

6、率。接合頻率高，則說明接合作用則強。
　　qPCR檢測基因表達量。收集待測菌液，并抽提細菌全RNA組。將RNA反轉錄為cDNA。以cDNA作為模板，利用qPCR檢測目的基因相對表達量。
　　構建基因traⅠ啟動子報告質粒pQF50-PtraⅠ。以質粒pQF50為載體，該質粒缺少Laz啟動子。運用分子克隆技術，將基因traⅠ啟動子及其上游317 bp片段，克隆于β-半乳糖苷酶基因上游。當基因traⅠ啟動子被激活時，其下游β-半

7、乳糖苷酶基因也被激活。后續(xù)通過β-半乳糖苷酶試驗(ONPG試驗)檢測酶活性，便能反映出基因traⅠ啟動子的表達狀況。酶活性高，則說明基因traⅠ表達上調。通過該實驗觀察AHL-SdiA對基因traⅠ的調控情況。
　　結果:
　?、賁M10λπ-PAO1進行接合反應。敲除PAO1基因1asⅠ、基因rhlⅠ，即AHL的缺失能提高SM10λπ接合頻率(P＜0.001);若在此基礎上，加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干預

8、接合反應，接合頻率則降低（P＜0.05）。敲除SM10λπ的基因sdiA，能增加SM10λπ-PAO1接合頻率(P＜0.001)。該結果提示，AHL與蛋白SdiA共同抑制SM10λπ接合作用。
　?、赟M10λπ-EC600進行接合反應。其中，受體菌EC600為大腸埃希菌，自身不合成AHL。加入AHL干預，接合作用受抑制，SM10λπ-EC600接合頻率降低(P＜0.001);而在敲除基因sdiA后，接合頻率又回復至原水平。但是，

9、在不加AHL干預時，在敲除基因sdiA后，SM10λπ-EC600的接合頻率相近。該結果說明，AHL抑制接合作用依賴于基因sdiA的表達。至此，實驗從表型上闡明了AHL-SdiA抑制質粒轉移。
　　③SM10λπ-PAO1進行接合反應。敲除PAO1基因lasL基因rh1Ⅰ,即AHL的缺失能上調SM10λπ基因traⅠ表達（P＜0.05）。若在此基礎上，加入3-oxo-C12-HSL、C4-HSL干預接合反應，SM10λπ基因tra

10、Ⅰ表達降低(P＜0.05)。敲除SM10λπ的基因sdiA，SM10λπ基因traⅠ表達上調（P＜0.05）。該結果從分子上闡明了AHL-SdiA抑制質粒轉移。
　　④將含有報告質粒pQF50-PtraⅠ大腸埃希菌BW25113進行ONPG試驗。加入AHL干預培養(yǎng)后，其β-半乳糖苷酶活性降低(P＜0.05)。而敲除BW25113基因sdiA或不加入AHL干預培養(yǎng)時，則均不降低酶活性。該結果說明，AHL-SdiA抑制基因traⅠ啟動

11、子。
　　⑤本實驗通過生物信息學方法，預測并初步驗證4條sRNA與基因sdiA調控成正相關性。敲除SM10λπ基因sdiA，能下調RnpB、SibA、SibB、EyeA等sRNA的表達。
　　結論:
　　實驗通過SM10λπ-PAO1、SM10λπ-EC600接合模型，從表型上闡明AHL-SdiA抑制質粒轉移。而后，通過qPCR檢測基因traⅠ表達變化及pQF50-PtraⅠ啟動子報告質粒實驗，從分子水平闡明了AHL-