α7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑對細胞損傷與保護的影響.pdf

1、α7煙堿型乙酰膽堿受體不僅在神經(jīng)細胞上表達,而且在非神經(jīng)細胞,例如內(nèi)皮細胞、巨噬細胞、上皮細胞和腫瘤細胞等均有分布表達,參與這些細胞的功能調(diào)節(jié),并與一些疾病的病理生理變化相關(guān)。將α7煙堿型乙酰膽堿受體作為靶點開發(fā)的受體激動劑已用于多種疾病的治療。研究目的:
　　 流行病學研究表明吸煙能導(dǎo)致多種心血管疾病,尼古丁作為香煙中主要有毒成分在其中起著重要的作用,但其作用機制并不十分清楚。同時,尼古丁在阿爾茨海默病中起到保護神經(jīng)細胞和提高

2、認知能力的作用。尼古丁作為α7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑,可能是通過激活受體發(fā)揮作用。本研究目的是探討尼古丁通過直接、間接刺激對臍帶靜脈血管內(nèi)皮細胞表達粘附分子的影響及其作用機制,然后探討gx-50-一種通過藥物軟件分析篩選獲得的特異性α7炯堿型乙酰膽堿受體激動劑對淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細胞損傷的影響。
　　 研究方法:
　　 首先,采用不同濃度的尼古丁刺激巨噬細胞(Ana-1),在各時間點收集巨噬細胞培養(yǎng)上清測定上

3、清中各細胞因子含量。并選擇6×10-5M,12小時處理組Ana-1細胞上清處理臍帶靜脈內(nèi)皮細胞,收集各時間點內(nèi)皮細胞的上清后檢測其中的可溶性粘附分子。并用抗TNF-α,抗IL-1β,抗IFN-γ,,抗TNF-α+抗IL-1β的單克隆抗體中和尼古丁處理的巨噬細胞上清液中相應(yīng)的細胞因子,再觀察其對血管內(nèi)皮細胞粘附分子表達以及對白細胞粘附能力的影響。
　　 其次,用不同濃度尼古丁刺激血管內(nèi)皮細胞,收集細胞上清用酶聯(lián)免疫吸附法檢測前列腺

4、素E2(PGE2)的表達。并提取細胞RNA與蛋白對環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達進行檢測。然后用βα7煙堿型乙酰膽堿受體拮抗劑銀環(huán)蛇毒素和NF-k抑制劑二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)預(yù)處理后觀察COX-2和PGE2的表達,并用凝膠遷移實驗檢測尼古丁與抑制劑處理后NF-kB的轉(zhuǎn)錄水平變化。最后用COX-2抑制劑NS-398預(yù)處理細胞后觀察尼古丁誘導(dǎo)的細胞間粘附分子-1蛋白表達變化。
　　 最后,用不同濃度的gx-50處理大鼠皮質(zhì)

5、神經(jīng)細胞,MTT法檢測其對細胞活性的影響。用MTT和PI/Hoechst33258雙染法觀察gx-50預(yù)處理后對淀粉樣蛋白誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)細胞損傷的影響,用實時定量PCR和Western blot法檢測相關(guān)凋亡基因的表達。最后用受體競爭性結(jié)合實驗檢測gx-50與α7乙酰膽堿受體的結(jié)合能力。
　　 結(jié)果：
　　 IL-1β在6×10-5M尼古丁處理后12小時達高峰,TNF-α在24小時達高峰。IL-8和IFN-γ的表達不受尼古

6、丁的影響。用6×10-5M的尼古丁處理Ana-1細胞12小時的上清刺激血管內(nèi)皮細胞,能上調(diào)siCAM-1、sVCAM-1和E-selectin的表達?？筎NF-α,抗IL-1β,抗TNF-α+抗IL-1β單克隆抗體中和Ana-1上清中的向應(yīng)細胞因子后,內(nèi)皮細胞表達sICAM-1和sVCAM-1的量明顯降低,且可以阻斷單個核細胞與血管內(nèi)皮細胞的粘附。此外,尼古丁可以濃度依賴性地增加COX-2基因表達和前列腺素E2的分泌,同時在乙酰膽堿受體

7、拈抗劑銀環(huán)蛇毒素和NF-kB抑制劑PDTC預(yù)處理后,這種表達增加明顯得到了抑制。而且用COX-2抑制劑NS-398預(yù)處理后,尼古丁誘導(dǎo)的ICAM-1表達也得到了抑制。
　　 在gx-50實驗中,結(jié)果顯示1×10-7～1×10-5M的gx-50對皮質(zhì)神經(jīng)細胞活性沒有顯著的影響。在1×10-6的gx-50預(yù)處理后,淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞凋亡數(shù)量明顯下降,并且使。Bcl-2/Bax比率顯著上升。另外,gx-50能夠結(jié)合到大鼠皮質(zhì)神經(jīng)

8、細胞表面的α7炯堿型乙酰膽堿受體。
　　 結(jié)論：
　　 綜上所述,尼古丁作為α7炯堿型乙酰膽堿受體激動劑可以通過巨噬細胞分泌炎性因子TNF-α,IL-1β間接誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達粘附分子ICAM-1和VCAM-1。同時,尼古丁還可以通過α7乙酰膽堿受體及NF-kB途徑直接刺激內(nèi)皮細胞表達炎性因子,并誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞表達ICAM-1。此外,gx-50作為一種潛在的α7煙堿型乙酰膽堿受體激動劑能夠有效地抑制Aβ325-35誘導(dǎo)的皮質(zhì)