昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體的組成及其藥理學特性研究.pdf

1、煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)是脊椎動物和無脊椎動物神經(jīng)系統(tǒng)中快速介導膽堿能突觸傳遞的配基門控離子通道。在脊椎動物中，nAChRs在神經(jīng)肌肉接頭以及中樞和周緣神經(jīng)系統(tǒng)中均有表達。在昆蟲中，nAChRs在神經(jīng)肌肉接頭處沒有分布，卻是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的神經(jīng)遞質(zhì)受體，是重要的殺蟲劑作用靶標。目前通過分子克隆和基因組測序技術在多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)了大量的nAChRs亞基，為昆蟲nAChRs的研究提供了堅實的基礎。在昆蟲nAChRs亞基功能研究

2、中，試圖體外組建昆蟲功能性nAChRs一直是國際研究熱點，但近20年來始終沒有突破，主要有兩個問題沒有解決:第一，昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)中nAChRs蛋白復合體的組成仍然未知;第二，在異源表達系統(tǒng)中無法獲得有功能的昆蟲nAChRs同型五聚體。
　　 本文利用非洲爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)，對褐飛虱的四個nAChRsα亞基與大鼠的nAChRsβ2亞基進行了體外重組，通過雙電極電壓鉗技術及放射性配基結(jié)合實驗研究了重組型受體的藥理學特性，并利用免疫共

3、沉淀技術對昆蟲內(nèi)源性nAChRsα亞基的組成進行了探索。通過搜索褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫及基因克隆獲得了兩個Ly-6/neurotoxin超家族基因，分別將其命名為Nl-lynx1和Nl-lynx2。在異源表達系統(tǒng)中檢測了這兩個lynx蛋白對重組型受體Nlα1/rβ2的調(diào)節(jié)作用，并對其調(diào)節(jié)機理進行了研究。
　　 一、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體α1、α2亞基的異源表達與功能研究吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑作為昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）

4、的選擇性激動劑，在農(nóng)業(yè)害蟲和衛(wèi)生害蟲的防治中應用廣泛。褐飛虱（Nilaparvata lugens）是亞洲許多地區(qū)的主要水稻害蟲。本文在異源表達系統(tǒng)中對褐飛虱nAChRs兩個α亞基Nlα1和Nlα2進行了體外重組，并對重組型受體的功能特性進行了研究。在非洲爪蟾卵母細胞中，Nlα1和Nlα2分別與哺乳動物的β2亞基共表達，均能夠形成有功能的受體，這與以往對于昆蟲α亞基的研究結(jié)果一致。兩種重組受體Nlα1/rβ2和Nlα2/rβ2對乙酰膽堿

5、的激動劑劑量反應相差不足兩倍，但是，Nlα1/rβ2受體對吡蟲啉的親和力顯著高于Nlα2/rβ2受體，其EC50分別為61±7μM（n=9）和870±76μM（n=13）。
　　 在卵母細胞中同時表達Nlα1，Nlα2和哺乳動物的β2亞基，所形成的受體對激動劑的劑量反應曲線介于Nlα1/rβ2受體和Nlα2/rβ2受體對激動劑的劑量反應曲線之間，但又與計算機模擬的兩種受體同時存在時的劑量反應曲線存在顯著差異，由此推測，N1α1，

6、Nlα2和哺乳動物的β2亞基可能組成一個三亞基五聚體Nlα1/Nlα2/rβ2。改變各亞基的注射比例，激動劑的EC50沒有顯著變化，進一步證明三個亞基共表達時形成的受體不是亞基組成不同的nAChRs的混合物，而是單一的重組型nAChRs。為證明在褐飛虱體內(nèi)Nlα1和Nlα2兩個亞基是否存在于同一個受體中，進一步研究昆蟲內(nèi)源性nAChRs的組成，本文分別以Nlα1和Nlα2亞基胞內(nèi)環(huán)的氨基酸序列為抗原制備特異性的多克隆抗體，進行了免疫共沉

7、淀，研究結(jié)果證明，在褐飛虱體內(nèi)Nlα1和Nlα2亞基的確存在于同一個受體中。
　　 二、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體α3、α8亞基的異源表達與功能研究昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體（nAChRs）是以吡蟲啉為代表的新煙堿類殺蟲劑的作用靶標。目前，通過基因組序列分析和基因克隆的方法在包括黑腹果蠅（Drosophilamelanogaster）在內(nèi)的多種昆蟲中鑒定出了大量的nAChRs亞基。系統(tǒng)發(fā)生關系的分析結(jié)果表明，果蠅Dβ2亞基與許多昆蟲的α

8、8亞基屬于同一個亞類群中。以往的研究中并沒有關于在異源表達系統(tǒng)中成功表達昆蟲α8/Dβ2亞類群nAChRs亞基的報道，但是，有證據(jù)表明Dβ2亞基可以與其它兩個亞基共聚，形成三亞基五聚體。
　　 本文通過RT-PCR和RACE技術克隆了褐飛虱Nlα8亞基(GenBank登錄號:FJ481979)，并首次報道了包含昆蟲nAChRsα8亞基的三亞基五聚體Nlα8/Nlα3/rβ2。Nlα8亞基基因全長2036bp，開放閱讀框為1617

9、bp，編碼538個氨基酸，與意大利蜜蜂（Apis mellifera）、赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）的nAChRsα8亞基具有較高的相似性，且具有nAChRsα亞基基因家族的特征結(jié)構(gòu)。在非洲爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)中，褐飛虱Nlα8亞基可以與哺乳動物β亞基rβ2共聚，形成重組型受體Nlα8/rβ2;也可以與Nlα3亞基及rβ2共聚，形成三亞基五聚體Nlα8/Nlα3/r

10、β2，且該受體對激動劑的劑量反應顯著高于Nlα8/rβ2 nAChRs。Nlα8/Nlα3/rβ2對吡蟲啉的最大反應電流Imax是Nlα8/rβ2的29.69倍。劑量依賴反應的研究結(jié)果表明，Nlα8/rβ2對乙酰膽堿的EC50是Nlα8/Nlα3/rβ2的5.58倍，而Nlα8/rβ2對吡蟲啉的EC50約是Nlα8/Nlα3/rβ2的40倍。免疫共沉淀的研究結(jié)果進一步證明，Nlα3與Nlα8亞基存在于同一個內(nèi)源性nAChRs中。

11、　　 三、昆蟲煙堿型乙酰膽堿受體附屬蛋白的克隆及其對受體的調(diào)節(jié)作用在昆蟲體內(nèi)或離體條件下，除了nAChRs亞基組成外，一些附屬蛋白，包括分子伴侶，調(diào)控因子或調(diào)節(jié)蛋白，在昆蟲nAChRs的蛋白折疊與成熟、復雜結(jié)構(gòu)組成、蛋白功能等方面起到十分重要的作用。本文通過搜索褐飛虱EST數(shù)據(jù)庫（http://bphest.dna.affrc.go.jp/;Noda et al.，2008）及基因克隆獲得了兩個Ly-6/neurotoxin超家族基因

12、，分別將其命名為Nl-lynx1和Nl-lynx2。Nl-lynx1和Nl-lynx2與螢火蟲Pr-lynx1基因的相似性分別為53％和50％，與小鼠lynx1基因的相似性分別為39％和41％，與小鼠lynx2基因的相似性分別為42％和44％。盡管褐飛虱Nl-lynx1和Nl-lynx2基因與螢火蟲的Pr-lynx1基因及脊椎動物的Ly-6/neurotoxin超家族的基因不具有較高的相似性，但是具有Ly-6/neurotoxin超家族

13、基因的特征結(jié)構(gòu)。在非洲爪蟾卵母細胞表達系統(tǒng)中，Nl-Lynx1和Nl-Lynx2能夠上調(diào)重組型受體Nlα1/rβ2對激動劑反應的最大電流，但是對受體對激動劑的敏感性沒有影響。Nl-Lynx1與重組型受體Nlα1/rβ2共表達時，受體對乙酰膽堿和吡蟲啉的Imax分別是單獨表達Nlα1/rβ2時的3.56倍和1.72倍;Nl-Lynx2與重組型受體Nlα1/rβ2共表達時，受體對乙酰膽堿和吡蟲啉的Imax分別是單獨表達Nlα1/rβ2時的3

14、.25倍和1.51倍。放射性配基結(jié)合實驗的結(jié)果表明，Nl-lynx1或Nl-lynx2與受體Nlα1/rβ2共表達只能增加配基的最大結(jié)合量（Bmx）不改變受體與配基結(jié)合的平衡常數(shù)（Kd），即不改變受體對配基的親和力。進一步的研究結(jié)果表明，Nl-lynx1或Nl-lynx2對受體的脫敏特性及nAChRs亞基表達水平?jīng)]有影響，且在一定范圍內(nèi)Nlα1/rβ2對激動劑的反應電流隨Nl-lynx注射量的增加而增大，由此推測，Nl-lynx對受體的

15、調(diào)節(jié)作用可能是通過提高蛋白質(zhì)折疊和亞基組裝的效率實現(xiàn)的。
　　 本文的研究結(jié)果表明，兩種不同的昆蟲nAChRsα亞基共表達可以提高受體對激動劑的反應，但仍需哺乳動物β亞基的參與才能夠在異源表達系統(tǒng)中構(gòu)建功能受體;附屬蛋白與受體亞基共表達仍然不能形成有功能的受體，由此推測昆蟲nAChRs的蛋白復合體中尚有未知的蛋白需要鑒定，試圖體外組建昆蟲功能性nAChRs可能需要更多的未知附屬蛋白。因此，本研究通過免疫共沉淀分離純化包含某一亞基

16、的昆蟲內(nèi)源性nAChRs蛋白復合體，經(jīng)SDS-PAGE電泳進行分離，LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定的方法，對nAChRs蛋白復合體中的未知蛋白鑒定進行了嘗試。雖然，由于抗體特異性等原因?qū)е妈b定出的蛋白數(shù)量過多，難以篩選出目的蛋白并對其功能進行驗證，但是，應用免疫共沉淀，親和層析等方法對昆蟲nAChRs蛋白復合體進行分離純化，結(jié)合基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，通過質(zhì)譜對其組分進行鑒定的方法仍然具有可行性。應用蛋白質(zhì)組學和基因組學的技術手段，鑒定昆蟲nA