α7-煙堿型乙酰膽堿受體在肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、遷移和凋亡的作用.pdf

1、目的:探討α7-煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor，nAChR)在人肺腺癌細(xì)胞株A549增殖、遷移和凋亡的作用。
　　方法:蛋白印跡法檢測(cè)α7亞基型煙堿型乙酰膽堿受體(α7 nicotinic acetylcholinereceptor，α7-nAChR)在不同肺癌細(xì)胞株中的表達(dá)，篩選出α7-nAChR穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，作為α7-nAChR在肺癌細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的作用研究的細(xì)胞

2、株;將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549隨機(jī)分成如下3組:空白對(duì)照組、激動(dòng)劑（溴化乙酰膽堿）組、拮抗劑（甲基牛扁亭堿）組，加入不同濃度梯度的激動(dòng)劑、拮抗劑，分別作用A549細(xì)胞24、48、72h; MTT篩選出nAChR激動(dòng)劑和拮抗劑對(duì)細(xì)胞增殖促進(jìn)和抑制的最佳濃度和時(shí)間點(diǎn);將對(duì)數(shù)期A549細(xì)胞隨機(jī)分為3組:（空白對(duì)照組、激動(dòng)劑組、拮抗劑組），MTT篩選出的最佳的濃度作用最佳時(shí)間作用A549后，分別用RT-PCR法和免疫熒光法檢測(cè)α7-nAChR的表達(dá)

3、;MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞增殖情況;細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移情況;Tunel檢測(cè)凋亡情況，蛋白印跡法檢測(cè)caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2表達(dá)。
　　結(jié)果:A549、SCLC和LA795三種細(xì)胞生長(zhǎng)曲線提示:48h和72h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞大量增殖;RT-PCR和Western blotting示人肺腺癌A549株穩(wěn)定高表達(dá)α7-nAChR; MTT示:與對(duì)照組相比，10-3mol/

4、Lα7-nAChR拮抗劑作用A549細(xì)胞株48h后能夠明顯抑制細(xì)胞的增殖(P＜0.01)，10-3mol/Lcα7-nAChR激動(dòng)劑作用A549細(xì)胞48h后細(xì)胞增殖明顯(P＜0.01); RT-PCR和免疫熒光示:α7-nAChR在三組均不同程度的表達(dá)，與對(duì)照組相比，激動(dòng)劑組α7-nAChR表達(dá)稍增強(qiáng)，拮抗劑組α7-nAChR表達(dá)者明顯減弱;劃痕試驗(yàn)示:拮抗劑抑制A549細(xì)胞遷移，相反激動(dòng)劑促進(jìn)遷移;Transwell試驗(yàn)示:對(duì)照組穿膜

5、細(xì)胞數(shù)為39.3±4.0(SP×200)，拮抗劑組穿膜細(xì)胞數(shù)為25.5±3.8(SP×200)，激動(dòng)劑組穿膜細(xì)胞數(shù)為68±5.5(SP×200)，激動(dòng)劑組和拮抗劑組分別于對(duì)照組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01); Tunel示:α7-nAChR拮抗劑組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組多，明顯促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，α7-nAChR激動(dòng)劑組與對(duì)照組無(wú)細(xì)胞凋亡;Western blotting檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白示:拮抗劑組促凋亡蛋白caspase-3、cas