TNF-α、IL-1β及LPS對骨關節(jié)炎軟骨細胞蛋白聚糖代謝的作用以及菊蒿成分（Parthenolide）的保護作用初探.pdf

1、目的：利用體外培養(yǎng)的人OA關節(jié)軟骨細胞體系，通過不同的測定方法觀察三種細胞因子(TNF-α、IL-1β和LPS)對體外培養(yǎng)的人OA關節(jié)軟骨細胞的蛋白聚糖的影響；并通過相同的實驗體系初步了解PAR是否對人OA軟骨細胞的蛋白聚糖代謝具有保護作用。 方法：本研究分為三部分：①軟骨細胞的體外培養(yǎng)和細胞活性的鑒定；②細胞因子TNF-α、IL-1β及LPS對軟骨細胞蛋白聚糖代謝的調節(jié)作用；③PAR對TNF-α、IL-1β及LPS誘導的軟骨細

2、胞蛋白聚糖代謝異常的保護作用。具體方法如下： 1.軟骨細胞取自人OA膝關節(jié)置換術后的股骨髁。采用第一代體外培養(yǎng)的軟骨細胞，用MTT法檢測細胞的存活率，以細胞存活率大于95％為標準，選擇合適的細胞因子及PAR的作用濃度。 2.將軟骨細胞分為不同條件的培養(yǎng)組，分別為：對照組、PAR組、IL-1β組、TNF-α組、LPS組、PAR+IL-1β組、MR+TNF-α組及PAR+LPS組。 3.用二甲基亞甲蘭(1,9-dim

3、ethylmethy lerie blue，DMMB)分光光度法測定不同組軟骨細胞及培養(yǎng)液中的GAG含量，計算GAB釋放入培養(yǎng)液中的百分率。此為蛋白聚糖降解的標記物，比較各組間的差別。 4.應用抗蛋白聚糖單克隆抗體(Mab)-5D4及383，分別采用ELISA法及WesternBlotting法，檢測并比較不同條件培養(yǎng)液中的兩種蛋白聚糖代謝片段的含量。其中Mab-5D4可檢測蛋白聚糖核心蛋白的KS鏈，Mab-3B3可檢測蛋白聚糖

4、核心蛋白的CS鏈。 5.應用半定量RT-PCR方法，測定不同條件培養(yǎng)的軟骨細胞中8種細胞成分的mRNA表達。8種細胞成分分別為：TNF-α、IL-1β、蛋白聚糖、ADAMTS-4、ADAMTS-5、TIMP-1、COX-lI及MAPK-1。 結果：1.在一定作用濃度的各種細胞因子及PAR作用下，除了LPS組的部分細胞形態(tài)略有梭形變外，其余各組細胞形態(tài)在光鏡下無明顯差別；各組細胞的存活率均大于95％。2.TNF-a、IL-

5、1β和LPS組軟骨細胞GAG釋放的百分率均明顯高于對照組，同時培養(yǎng)液中的5D4片段也明顯高于對照組；LPS組培養(yǎng)液中383片段明顯低于對照組，而TNF-a、IL-1β組培養(yǎng)液中的383片段與對照組比較無差別。3.TNF-α、IL-1β和LPS可不同程度地影響軟骨細胞內不同細胞因子的mRNA表達：①三種細胞因子均可上調軟骨細胞內的ADAMTs-4、TNF-a、IL-1β及COX-II的mRNA表達；同時下調蛋白聚糖的mRNA表達。②TNF

6、-a和LPS可促進培養(yǎng)的軟骨細胞內ADAMTS-5及MAPK-1的mRNA表達；而IL-1β組此兩種細胞成分的mRNA表達與對照組無差別。③三種細胞因子對軟骨細胞的TIMP-1mRNA表達均無影響。4.PAR+IL-1β組、PAR+TNF-α及PAR+LPS組的軟骨細胞GAG的釋放率均低于其相應的單獨細胞因子組。說明PAR可分別抑制TNF-α、IL-1β及LPS所導致的體外培養(yǎng)的人OA關節(jié)軟骨細胞GAG的釋放。5.PAR+IL-1β組、

7、PAR+TNF-α及PAR+LPS組的培養(yǎng)液中5D4片段均低于其相應的單獨細胞因子組，即PAR可抑制這三種細胞因子所導致的軟骨細胞蛋白聚糖核心蛋白區(qū)硫酸角質素鏈的降解。6.RT-PCR的結果顯示：①PAR可下調TNF-α、IL-1β及L2S所導致的體外培養(yǎng)的人OA關節(jié)軟骨細胞內ADAMTS-5及TNF-α的mRNA過度表達；并同時上調蛋白聚糖mRNA表達。②PAR可下調IL-1β所致的ADAMTS-4的mRNA過度表達；③PAR可下調T

8、NF-α及IL-1β所致的IL-1β的mRNA過度表達；④PAR可下調TNF-α及LPS所致的COX-II及MAPK-1的mRNA過度表達。 結論：⑴在不改變細胞存活率的情況下，TNF-α、IL-1β及LPS可促進體外培養(yǎng)的人OA關節(jié)軟骨細胞蛋白聚糖的降解，尤其是核心蛋白區(qū)硫酸角質素鏈的降解.推斷三種細胞因子在OA的發(fā)病中起著一定的作用；而PAR可不同程度地減輕以上三種細胞因子所導致的蛋白聚糖降解。⑵TNF-α、IL-1βB和L