抗病毒治療過程中慢性乙型肝炎患者機體免疫功能變化的臨床研究.pdf

1、目的：研究抗病毒治療過程中不同時期慢性乙型肝炎(chronichepatitisB，CHB)患者外周血漿細胞因子(IL-2、IL-6、IL-18、IP-10、IFN-γ、TNF-α)水平特征，并探討其臨床意義。通過對慢乙肝患者抗病毒治療過程中不同時期外周血T細胞抗原受體beta鏈可變區(qū)((TCRβchainvariablegene，TCRBV)各基因家族克隆性擴增情況的比較，探討抗病毒治療過程中慢乙肝患者外周血T細胞群組成的變化，及外周

2、血抗原特異性T細胞的變化情況。結(jié)合患者臨床病程及本研究中的免疫應(yīng)答物等參數(shù)，分析抗病毒治療效果與機體免疫功能指標的關(guān)系，也為乙肝患者機體抗藥性和長期藥物治療后耐藥性的產(chǎn)生提供檢測依據(jù)。
　　 方法：
　　 1．ELISA法檢測血漿IL-2、IL-6、IL-18、IP-10、IFN-γ、TNF-α水平
　　 選擇慢乙肝患者33例，其中男20例，女13例，平均年齡32.56±8.61歲。按規(guī)范給予馬來酸恩替卡韋抗病毒

3、治療，并分別于服用抗病毒藥物前、治療第12周、24周、48周分別采血，均空腹采血2管，每管5m1，1管分離血清用于肝功能及HBVDNA拷貝數(shù)檢測，另一管抗凝后分離血漿和外周血單個核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)，采用雙抗體夾心ELISA法檢測細胞因子IL-2、IL-6、IL-18、IP-10、IFN-γ、TNF-α等水平，其中PBMC保存于-70℃?zhèn)溆谩?br>　　 2．基因熔解譜型圖(

4、genemeltingspectralpattem，GMSP)技術(shù)檢測TCRBV基因CDR3譜型
　　 根據(jù)文獻設(shè)計、合成人T細胞TCRBV家族24個基因家族上游引物26條(BV5、BV13各有二個亞家族)和共同的T細胞抗原受體beta鏈恒定區(qū)基因(TCRβchainconstantgene，TCRBC)下游引物1條；TCRBC對照的TCRBCl引物1條、beta-actin上下游引物各1條。選擇7例CHB患者(男5例，女2例，

5、平均27.45±4.17歲)為研究對象，10例健康體檢者(男5例，女5例，平均年齡28.73±4.87歲)為對照組，健康體檢者留外周靜脈血5ml。Ficoll試劑密度梯度離心法分離慢乙肝患者和健康獻血者PBMC。提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以TCRBV基因24個家族特異性引物，實時熒光PCR結(jié)合DNA熔解曲線技術(shù)擴增24個TCRBV基因家族(包括完整的CDR3區(qū))，建立TCRBV各基因家族的GMSP，根據(jù)TCRBV基因家族的GMS

6、P特征，分析各家族的單/寡/多克隆性增生。
　　 結(jié)果：
　　 1．血清ALT、HBVDNA水平抗病毒治療前及治療后不同階段有差別(F值分別為17.69，198.98，均P＜0.05)，其中ALT水平治療后第12周、第24周、第48周與治療前相比均有明顯下降(均P＜0.05)；血清HBVDNA水平治療后第12周、第24周、第48周與治療前比較均有明顯下降(均P＜0.05)，且治療第24周與第12周之間、第48周與第24周

7、之間、第48周與第12周之間比較均有明顯下降(均P＞0.05)。血清ALT與HBVDNA水平間呈正相關(guān)，r為0.581、P值小于0.05。
　　 2．血漿IL-18、IP-10水平抗病毒治療前及治療后不同階段有差別(F值分別為7.59，14.14，均P＜0.05)，兩者治療后第12周、第24周、第48周與治療前相比均有明顯下降(均P＜0.05)；血漿IFN-r、TNF-a水平治療前后均有差別(F值分別為3.845，20.156，

8、均P＜0.05)，血漿IFN-r、TNF-a水平治療后第24周與治療前及治療后第12周比較均有明顯下降(均P＜0.05)，但血漿IFN-r水平治療后第48周與治療前、治療后第12周、24周比較有明顯上升(均P＜0.05)；血漿IL-2、IL-6水平治療前后比較無顯著性差異(F值分別為0.01，0.932，均P＞0.05)。
　　 3．血漿IL-18、IP-10、IFN-r、TNF-a水平與血清ALT水平均呈正相關(guān)，r分別為0.3

9、23、0.663、0.396、0.316，P值分別小于0.05、小于0.01、小于0.05、小于0.05；血漿IL-2、IL-6水平與血清ALT水平之間無明顯相關(guān)性。
　　 4．血漿IL-18、IP-10、TNF-a水平與血清HBVDNA水平均呈正相關(guān)，r分別為0.382、0.559、0.286，P值分別小于0.05、小于0.01、小于0.05;血漿IL-2、IL-6、IFN-r水平與血清HBVDNA水平之間無明顯相關(guān)性。

10、>　　 5．治療前7例慢乙肝患者中有6例患者的TCRBV基因家族CDR3出現(xiàn)偏克隆(單或寡)擴增，出現(xiàn)異常擴增的家族總數(shù)共計34個；在健康獻血者對照組，10例健康人中有3例出現(xiàn)偏克隆擴增，共計8個家族；慢乙肝患者TCRCDR3偏克隆擴增率高于健康對照組(單側(cè)累積概率P≈0.036，0.01＜P＜0.05)。經(jīng)抗病毒治療后，隨著HBVDNA水平下降(7例患者較治療前均有明顯下降，P＜0.05)，有2例慢乙肝患者TCRBV由偏克隆擴增向多

11、克隆轉(zhuǎn)變，但治療后偏克隆擴增率與治療前比較無差別(雙側(cè)累積概率P≈0.559，P＞0.05)。
　　 6．對在基因熔解譜型圖(genemeltingspectralpattern，GMSP)上表現(xiàn)為單峰的TCRBV基因家族進行測序，發(fā)現(xiàn)慢乙肝患者TCRBV某些TCRBV基因家族出現(xiàn)單克隆擴增，我們研究的7例樣本中，沒有發(fā)現(xiàn)相同TCRBV基因序列，但單一患者在治療過程中單克隆擴增的某-TCRBV基因家族的CDR3序列是不變的。

12、r>　　 結(jié)論：
　　 1．抗病毒(馬來酸恩替卡韋)治療后CHB患者外周血漿細胞因子IL-18、IP-10、IFN-r、TNF-a水平隨著HBVDNA水平的下降，而有不同程度的下降，并且與血清ALT水平或HBVDNA水平有一定的相關(guān)性，表明細胞因子參與了慢乙肝的發(fā)病過程，其血漿水平不但可以反映抗病毒治療過程中患者機體的免疫功能狀態(tài)的動態(tài)變化，而且可以作為抗病毒藥物療效評價的參考指標；HBVDNA水平下降也表明抗病毒治療可使細胞

13、免疫功能有所恢復(fù)，從而強化機體清除HBV的能力。
　　 2．與健康獻血者比較，CHB患者TCRBVCDR3基因家族的偏移率(skewedfrequency)較高，但在接受馬來酸恩替卡韋抗病毒治療后，隨著HBVDNA表達量的下降，TCRBV基因家族的偏移情況(單/寡克隆性擴增)有好轉(zhuǎn)，TCRBV基因有向多克隆擴增轉(zhuǎn)變的趨勢，提示抗病毒治療有利于CHB患者細胞免疫功能恢復(fù)。另外慢乙肝患者出現(xiàn)的單克隆擴增TCRBV基因家族，可能慢乙肝