毛細(xì)管電泳應(yīng)用于生物活性物質(zhì)的分離和檢測.pdf

1、毛細(xì)管電泳(capillaryelectrophoresis，CE)是離子或荷電粒子以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中組分之間的淌度或分配系數(shù)的差異，而實現(xiàn)高效、快速分離的一類電泳新技術(shù)。與傳統(tǒng)的高效液相色譜技術(shù)相比，毛細(xì)管電泳具有分離模式多、分離效率高.、分析速度快、試劑和樣品用量少、成本低、應(yīng)用范圍廣等特點，己廣泛應(yīng)用在無機離子、糖類、氨基酸、蛋白質(zhì)、核酸、環(huán)境樣品、藥物、食品和手性對映體的分離分析。毛細(xì)管電泳的理論

2、和應(yīng)用研究是分析化學(xué)最活躍的領(lǐng)域之一。迄今為止，如何提高毛細(xì)管電泳對藥物的分離選擇性和檢測靈敏度仍然是分析工作者關(guān)注的問題之一。本論文在前人工作的基礎(chǔ)上建立基于高效快速分離，高靈敏度檢測的毛細(xì)管電泳新體系，并將其應(yīng)用到實際生物樣品的分析中，圍繞“高分離柱效、高靈敏度”為主要目標(biāo)，主要開展了如下的探索性工作:
　　 第一部分，回顧了毛細(xì)管電泳的發(fā)展歷史，對毛細(xì)管電泳技術(shù)的基本理論、分離模式、應(yīng)用特點，以及聯(lián)用技術(shù)等進行了介紹。著重

3、討論了毛細(xì)管電泳的修飾分離模式用于實際樣品分析中的發(fā)展熱點。最后，以方法的建立，完善優(yōu)化分離體系為出發(fā)點，提出本論文的主要研究內(nèi)容。
　　 第二部分，研究了運用β-CD修飾的自組裝膠束毛細(xì)管電泳-電化學(xué)檢測手段快速分離親脂性手性異構(gòu)體1-苯基-順，反-四氫異喹啉(ER，ES)。運行緩沖液為含有30mM脫氧膽酸鈉，20mMβ-CD和20％(v/v)乙腈的磷酸鹽(35mmol/LpH=7.85)膠束體系。緩沖液中，表面活性劑脫氧膽酸

4、鈉形成膠束粒子，β-CD作為手性選擇劑和ACN作為有機溶劑提高分離效率。優(yōu)化了檢測電壓，分離電壓，進樣時間和緩沖液的組成，異構(gòu)體在12min內(nèi)達(dá)到了手性分離。被分析物遷移時間和峰面積(n=5)的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別是2.3％(ER)，2.7％(ES)and2.0％(ER)，3.5％(ES);手性異構(gòu)體的檢測限是0.5μmol/L(ER)，0.2μmol/L(ES)。在ER/ES為1/500的條件下，能測定出恒量ER的濃度。這種方法

5、成功應(yīng)用于跟蹤藥物合成中間體ES中異構(gòu)體ER的量。
　　 第三部分，在膠束修飾毛細(xì)管電泳提高分離效率的基礎(chǔ)上，探索微乳體系毛細(xì)管內(nèi)壁分子膜修飾分離手性藥物。聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)/β-環(huán)糊精(β-CD)修飾微乳毛細(xì)管電泳用來手性分離舍曲林異構(gòu)體。由乙腈，十二烷基硫酸鈉，正丁醇和環(huán)己烷與硼砂組成的微乳緩沖液極大地提高了舍曲林順反異構(gòu)體的分離效率。在優(yōu)化條件下，4種順反異構(gòu)體達(dá)到了基線分離。四種順反異構(gòu)體的檢測下限分別是

6、0.15mg/mL(1S，4S)，0.15mg/mL(1R，4R)，0.30mg/mL(1S，4R)和0.30mg/mL(1R，4S)。同時研究了該體系的分離機理并用于實際樣品左洛夫片劑中有效成分的測定，取得了滿意的測定效果。
　　 第四部分，本著提高檢測技術(shù)的靈敏度，為生命體系中藥物代謝及原產(chǎn)物的測定奠定基礎(chǔ)，提出運用電化學(xué)方法修飾電極測定市售片劑中的藥物含量的方法。通過電化學(xué)鍵合蘆丁對玻碳電極進行修飾。該修飾電極對舍曲林的氧

7、化具有電催化作用，因此用來測定藥物片劑中舍曲林的含量。同時對電極修飾的機理和修飾電極的電化學(xué)行為進行了系統(tǒng)的討論。結(jié)果顯示，玻碳電極的修飾是通過蘆丁作為邁克爾反應(yīng)的的受體親核進攻碳表面的羥基而鍵合。修飾上去的蘆丁分子內(nèi)酚羥基發(fā)生2e/2H+可逆的氧化還原反應(yīng)催化了舍曲林在電極表面的氧化。使用紅外光譜和電化學(xué)技術(shù)考查了舍曲林的氧化機理。結(jié)果顯示，舍曲林在修飾電極表面的催化氧化屬于不可逆2e/2H+氧化反應(yīng)。使用脈沖伏安分析法測定了舍曲林的

8、氧化峰電流與其濃度在3.0-90.0μM范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其檢測限為1.0μM。在此方法基礎(chǔ)上，對左洛夫樣品中舍曲林濃度的進行了測定，同樣取得了滿意的效果。
　　 第五部分，在聚合物修飾毛細(xì)管電泳條件下，兩種革蘭氏陽性菌（枯草芽孢桿菌BS和金黃葡萄球菌SAR）與一種革蘭氏陰性菌（銅綠假單孢菌PA）實現(xiàn)了很好的基線分離。聚合物（聚環(huán)氧乙烷，PEO）和β-環(huán)糊精(β-CD)的聯(lián)合使用提高了細(xì)菌BS和PA的分離效率。分離條件中的影響因

9、子例如PEO和β-CD的濃度，緩沖體系的pH值與濃度，分離電壓和進樣時間等。由于溶菌酶對革蘭氏陽性菌有很好的破壁而催化水解作用，因此，在革蘭氏陰性菌PA共存的條件下，BS和SAR的水解情況進行了探討，根據(jù)不同時間BS和SAR的水解量，計算出水解速率常數(shù)。結(jié)果顯示，修飾劑PEO和β-CD，還有緩沖液的pH值和濃度都不僅影響了分離效率，同時，在不適合的pH和濃度范圍內(nèi)，都將導(dǎo)致細(xì)菌的破壁作用。根據(jù)實驗結(jié)果，確定最佳分離條件為10mmol/L

10、PBS(pH7.2)，PE00.02％和β-CD0.02％，進樣時間2s，分離電壓控制在20kV。BS,PA和SAR三種菌的檢測限分別為1.2×102cells/mL，1.1×102cells/mL和0.8×102cells/mL。雞蛋清溶菌酶(HEWL)對革蘭氏陽性菌BS，SAR有很好的催化水解作用，但對PA的水解作用不明顯。這樣為細(xì)菌革蘭氏菌種的篩選提供了可參考的方法。
　　 第六部分，在上述運用毛細(xì)管電泳修飾體系分離生物手