精液氧化應(yīng)激檢測及其在輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用.pdf

1、第一部分、精液氧化應(yīng)激水平與男性不育的相關(guān)性研究
　　 目的：通過化學(xué)發(fā)光法檢測不育男性及志愿者原始精液中活性氧(ROS)水平，以探討精液氧化應(yīng)激水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性。
　　 方法：不育對象來自2005.1—2007.12在上海市計劃生育科學(xué)研究所附屬生殖醫(yī)院不孕不育門診進行精液檢查的男性，共451例不育男性和50名志愿者納入本研究；
　　 使用計算機輔助精子分析系統(tǒng)檢測精子密度，動力學(xué)參數(shù)等指標；
　　

2、 使用Diff-Quik染色法評價精子形態(tài)學(xué)指標；
　　 使用化學(xué)發(fā)光法檢測所有研究對象原始精液中活性氧水平，使用白細胞特異探針FMLP檢測白細胞；
　　 采用匹配的方法選擇30份精液，按照活性氧水平分為低、中、高三組，離心分離精漿后，進行人類精子活力試驗(HSMA)以評價三組精漿對精子運動的毒性作用。
　　 結(jié)果：
　　 1.志愿者和不育男性原始精液中ROS水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3、>　　 2.451份不育患者精液ROS水平呈偏鋒分布，中位數(shù)為9.68 RLU/s每20×106精子。
　　 3.以50名志愿者精液ROS水平的95百分位數(shù)作為閾值，將不育患者精液分為氧化應(yīng)激陰性組和陽性組，陽性率為46.6％。
　　 4.相關(guān)性分析提示：精子主要的動力學(xué)參數(shù)和部分形態(tài)學(xué)指標與ROS水平存在相關(guān)。
　　 5.根據(jù)FMLP激惹試驗結(jié)果，將氧化應(yīng)激陽性的精液標本分為白細胞主導(dǎo)的和非白細胞主導(dǎo)的氧化應(yīng)

4、激陽性。其中，白細胞因素約為24.3％。
　　 6.HSMA的結(jié)果表明氧化應(yīng)激水平對精子的毒性有劑量-效應(yīng)關(guān)系。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究檢測了451份不育男性患者精液的ROS水平，氧化應(yīng)激陽性率為46.6％，其中精漿白細胞因素約占24.3％。
　　 2.原始精液ROS水平與精子的活率和形態(tài)學(xué)參數(shù)顯著相關(guān)3.體外精子活力試驗表明氧化應(yīng)激對精子有毒性作用。
　　 第二部分、一種檢測精子質(zhì)膜損傷

5、的新技術(shù)
　　 目的：建立一種適宜臨床用于檢測人類精子質(zhì)膜完整性并評價氧化應(yīng)激對精子質(zhì)膜損傷程度的新技術(shù)。
　　 方法：
　　 1.篩選出新的熒光染料Transgreen，配合PI，代替市售昂貴的LIVE/DEADSperm Viability Kit試劑盒檢測精子質(zhì)膜完整性。熒光染料使質(zhì)膜完整的精子發(fā)綠色熒光，質(zhì)膜不完整的精子發(fā)紅色熒光。在熒光顯微鏡下計數(shù)綠色精子的百分比，即存活率(viability)。

6、>　　 2.用Transgreen/PI復(fù)染法與LIVE/DEAD Sperm Viability Kit檢測同一批精子標本，分析檢測結(jié)果的相關(guān)性。
　　 3.以不同的順序和間隔時間加入Transgreen和PI檢測同一批精子標本，以比較Transgreen和PI與精子核的親和力大小。
　　 4.采用體外培養(yǎng)法觀察各種染料對精子運動的毒性作用。
　　 5.用Transgreen/PI熒光復(fù)染法檢測451份不育男

7、性精子的存活率；分析精液中氧化應(yīng)激水平和精子質(zhì)膜完整性的關(guān)系。
　　 6.用熒光酶標儀檢測Transgreen與LIVE/DEAD Sperm Viability Kit中的SYBR-14染料與精子共孵育時的熒光強度隨時間的變化曲線。
　　 7.通過熒光酶標儀檢測綠色熒光的強度，加入Transgreen或SYBR-14后所有精子激發(fā)綠色熒光，強度測得A；再加入PI，PI將死精子中與染色體結(jié)合的綠色染料取代，此時再測綠色熒

8、光強度B，定義一個新的指標--精子存活系數(shù)=B/A，即代表活精子(質(zhì)膜完整的精子)發(fā)光強度與所有精子發(fā)光強度的比值。
　　 8.用熒光酶標儀間隔5 min檢測同一批精液標本兩次，分析時間(觀察者內(nèi))的可靠性(精確性)；用熒光顯微鏡下計數(shù)法做同樣的檢測。比較兩種方法的可靠性(精確性)。
　　 9.將同一份精液洗滌濃縮，再稀釋為不同的密度組，用熒光酶標儀檢測其存活系數(shù)。
　　 10.用熒光酶標儀和熒光顯微鏡下計數(shù)法檢

9、測同一批精液標本，分析檢測結(jié)果的相關(guān)性，探討存活系數(shù)是否能夠替代傳統(tǒng)指標存活率。
　　 結(jié)果：
　　 1.Transgreen/PI與LIVE/DEAD Sperm Viability Kit復(fù)染法檢測同一批精子存活率，相關(guān)系數(shù)R=0.927，P<0.001。
　　 2.精液中Transgreen和PI染料加入順序?qū)哟婊盥实臋z測結(jié)果沒有影響(P>0.05)。
　　 3.Transgreen/PI與LI

10、VE/DEAD Sperm Viability Kit一樣，在加入后2h內(nèi)，不影響精子的正常運動功能(P>0.05)。
　　 4.用Transgreen/PI熒光顯微鏡下計數(shù)檢測不育男性精子存活率，氧化應(yīng)激陰性和陽性組精子存活率差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 5.Transgreen穿膜進入精子并與染色體結(jié)合即可用熒光酶標儀檢測到綠色熒光，熒光強度上升較平緩，約40～50min到達平衡。SYBR-14上升較快，約20min到達

11、平衡。
　　 6.同種方法不同時刻兩次測量精子質(zhì)膜完整性，使用熒光酶標儀時，R=0.971，P<0.001；使用熒光顯微鏡下計數(shù)法時，R=0.869，P<0.01。
　　 7.同一份精液稀釋為不同密度組，用熒光酶標儀檢測存活系數(shù)，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 8.存活系數(shù)和存活率的相關(guān)系數(shù)R=0.897，P<0.001。
　　 結(jié)論：
　　 1.Transgreen/PI與LIVE/DEAD Sp

12、erm Viability Kit檢測結(jié)果有非常好的一致性。因此Transgreen/PI可以作為精子存活率檢測的方法使用。
　　 2.PI與細胞核的親和力大于Transgreen，使用者不用考慮先加哪個試劑，甚至可以同時加入Transgreen和PI，即可在熒光顯微鏡或流式細胞儀中檢測精子的存活率。
　　 3.Transgreen/PI處理2h后對精子運動無毒性作用，因此不影響染色后在熒光顯微鏡下同時檢測存活率和活力，

13、而且熒光染料只對細胞染色的特征可以排除非細胞成分的干擾，因此精子計數(shù)將更準確。
　　 4.Transgreen與SYBR-14同DNA完全結(jié)合所用時間不同。因此應(yīng)根據(jù)不同的核染料選擇恰當?shù)臅r間測量存活系數(shù)。
　　 5.氧化應(yīng)激陰性組精子存活率高于陽性組，這與理論相符，也從側(cè)面反映了新型染料在臨床應(yīng)用的價值，可成為今后評價精子抗氧化治療效果的良好指標。
　　 6.用新指標存活系數(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的存活率來評價精子質(zhì)膜完整性

14、，該指標適合描述用熒光酶標儀間接檢測出的質(zhì)膜完整精子百分比。用熒光酶標儀測量精子存活系數(shù)的可靠性很高。而常用的熒光顯微鏡下計數(shù)法主觀因素強，樣品在載玻片上分布不均勻，測量的精子數(shù)量十分有限，因此誤差較大。而熒光酶標儀以樣品所有精子DNA的熒光強度為基礎(chǔ)進行測量，測量的精子數(shù)量巨大，對樣品信息的利用更多，很好地避免了隨機誤差。且基本上克服了研究者主觀因素的影響，提高了檢測效率。
　　 7.存活系數(shù)是一個比值，沒有單位，不受絕對熒光

15、強度的影響。不論精子數(shù)量多少，熒光強度多高，只要質(zhì)膜完整的精子比例恒定，存活系數(shù)也是一個定值。因此，使用熒光酶標儀無需事先處理精子，無需調(diào)整密度，可以直接加樣測量，十分方便。
　　 8.經(jīng)過相關(guān)性分析，熒光酶標儀和熒光顯微鏡下計數(shù)法的結(jié)果相關(guān)性較高，說明新指標存活系數(shù)能夠很好地反映存活率，用存活系數(shù)可以有效地評價精子質(zhì)膜的完整性。
　　 第三部分、中藥補腎生精湯抗氧化治療男性嚴重少、弱精子癥的研究
　　 目的：觀

16、察中藥補腎生精湯抗氧化治療男性嚴重少、弱精子癥患者的臨床效果。
　　 方法：將100例嚴重男性少、弱精子癥患者隨機分為中藥組(50例)和對照組(50例)，中藥組應(yīng)用補腎生精湯治療并指導(dǎo)同房3個月，對照組僅指導(dǎo)同房。治療后仍然未育患者中有83例(中藥組38例，對照組45例)接受了卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)助孕；觀察用藥前、后常規(guī)精液指標(密度、活力等)和活性氧水平的變化及臨床妊娠情況；比較兩組繼續(xù)接受ICSI治療的患者MⅡ卵子

17、數(shù)、受精率、卵裂率、可用胚胎率、平均移植胚胎數(shù)、臨床妊娠率。
　　 結(jié)果：
　　 1.中藥組用藥前后患者精子的密度、活率、A+B級精子比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；精液ROS水平明顯下降(P<0.05)。
　　 2.有4例患者在服用中藥后自然受孕，均已分娩健康新生兒。其中2例在本研究前已接受過ICSI治療，受精率低，卵裂率低，胚胎質(zhì)量差未孕，經(jīng)過本次中藥治療后自然懷孕。對照組無自然受孕者。