水稻錨蛋白基因OsBIHN-N22和酯酰輔酶A合成酶基因OsBNHN-N7的克隆鑒定與功能分析.pdf

1、在本實驗室前期研究中，證明了苯并噻二唑(benzothiadiazole，BTH)能誘導(dǎo)水稻對稻瘟病、白葉枯病和紋枯病等病害的系統(tǒng)抗病性，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用抑制性差減雜交法分離鑒定了200多個與水稻抗病反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)cDNA。同源性搜索發(fā)現(xiàn)，其中一個差別表達(dá)克隆BIHN-n22含有623bp的插入片段，該插入片斷編碼的蛋白與植物中ankyrin(錨蛋白)類型蛋白具有高度相似性。進(jìn)一步搜索發(fā)現(xiàn)GenBank數(shù)據(jù)庫中的水稻cDNA序列發(fā)現(xiàn)

2、有一個長度為1529 bp的差別表達(dá)cDNA克隆J023125M12，(GenBank accession NO．AKl21370)和一個1475bp的cDNA克隆J013000M21(GenBank accession NO．AK098858)(Kikuchi，S et al．，2003)，它們與本序列的相似性都達(dá)到99％，與植物ankyrin(錨蛋白)類型蛋白具有高度相似性。為研究探討這個可能的錨蛋白基因的生物學(xué)功能以及在水稻抗病牲

3、中的作用，我們以這個已知序列設(shè)計引物，我們以前期構(gòu)建好的水稻全長cDNA文庫為模板克隆了這個基因，并命名為OsBIHN-N22。 OsBIHN-N22基因編碼蛋白由329個氨基酸組成，含有3個保守的ANK重復(fù)。這個蛋白屬于ANK家族。細(xì)胞定位分析表明這個蛋白定位在細(xì)胞膜上。對其基因結(jié)構(gòu)分析表明OsBIHN-N22基因包含八個外顯子和七個內(nèi)含子。Southern雜交表明OsBIHN-N22基因在水稻基因組中以單拷貝的形式存在于水稻

4、的第九條染色體上。通過對OsBIHN-N22基因在水稻中的特異性表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，OsBIHN-N22能被苯并噻二唑(BTH)誘導(dǎo)表達(dá)，并且在BTH處理后的24h達(dá)到很高水平，在隨后的60h內(nèi)一直維持在相當(dāng)高的水平上。而在水處理的對照中發(fā)現(xiàn)OsBIHN-N22的表達(dá)水平在整個實驗檢測時期都較低。在BTH處理的水稻幼苗中，OsBIHN-N22基因的表達(dá)在受到稻瘟病菌M.grisea侵染后被快速激活。稻瘟病菌接種后0h即可檢測到OsBIHN-N

5、22基因的激活表達(dá)，而且在隨后的18h內(nèi)強(qiáng)度增加，并在48h內(nèi)維持在一個相當(dāng)高的水平上。在沒有BTH處理，只有稻瘟病菌接種的水稻葉片中直到6h才有誘導(dǎo)表達(dá)，然后在18h內(nèi)可以檢測到比較明顯的表達(dá)水平，隨后迅速降低。在水稻與稻瘟病菌的非親和性互作中，OsBIHN-N22基因在接種后的6h就能檢測到其快速表達(dá)，而在親和性互作中則只有在36h才有微弱的表達(dá)。 在與水稻抗病反應(yīng)相關(guān)的差異表達(dá)cDNA中，另外一個長度為1897bp的差別表

6、達(dá)克隆002-112-H10(GenBank accession NO．AK106615)。這個克隆與植物中的AMPBP(AMP-binding protein)蛋白家族中的酯酰輔酶A合成酶類(acyl-CoA Synthetases)有高度的相似性。我們以該cDNA克隆的已知序列設(shè)計了一對特異性引物，從水稻的cDNA文庫中通過PCR擴(kuò)增到這個序列，并把這個基因命名為OsBNHN-N7。 OsBNHN-N7基因編碼一個含有558

7、個氨基酸的蛋白，分子量為60.4kD，等電點(diǎn)為7.87，含有一個Caic(Acyl-CoA synthetases(AMP-forming)/AMP-acidligases Ⅱ)結(jié)構(gòu)域。Southern雜交顯示OsBNHN-N7基因以多拷貝的形式存在于水稻基因組內(nèi)。通過細(xì)胞定位實驗也證明OsBNHN-N7編碼蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上。 Northern雜交表明OsBNHN-N7基因在BTH處理后的24小時后有一個很高的表達(dá)水平；而在

8、水處理的對照中只有較低的本底表達(dá)水平。另外我們在研究中發(fā)現(xiàn)在BTH處理的水稻幼苗在受到M.grisea侵染后，OsBNHN-N7基因在接種后的6小時就被快速的激活表達(dá)，其后表達(dá)水平繼續(xù)增強(qiáng)并持續(xù)穩(wěn)定一個高水平上。在水處理的對照中，稻瘟病菌接種后36小時內(nèi)只有很微弱的低水平誘導(dǎo)表達(dá)。在利用水稻的一對近等位基因系H8R和H8S研究與稻瘟病菌的親和與非親和性互作中發(fā)現(xiàn)，與H8R的非親和性互作中，OsBNHN-N7基因能被快速激活表達(dá)，而與H8