新株型水稻潛在姜烯合成酶基因的克隆、表達(dá)和序列分析.pdf

1、萜烯類化合物作為植物次生代謝產(chǎn)物中最大的一個(gè)家族，在自然界中廣泛分布。在植物、植食性昆蟲及天敵三者之間扮演著“信使”角色，能夠引起昆蟲行為和生理上的多種反應(yīng)，是對(duì)昆蟲行為產(chǎn)生調(diào)控作用的一種重要因素。隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)高等植物體內(nèi)萜烯類化合物的次生代謝合成途徑及其相關(guān)合酶的研究日趨增多，多種生物體內(nèi)大量萜類合酶被克隆并功能分析。本研究在利用頂空固相微萃取一氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析了水稻揮發(fā)性化學(xué)成分的基礎(chǔ)上，根據(jù)KOME數(shù)據(jù)庫中

2、的水稻cDNA信息設(shè)計(jì)引物，以水稻葉片cDNA為模板，經(jīng)PCR獲得兩條萜烯合酶基因全長(zhǎng)序列，并將克隆得到的基因在大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行異源表達(dá)。另外從生物信息學(xué)角度，對(duì)所得基因的核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列的結(jié)構(gòu)特征、疏/親水性、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、功能域和系統(tǒng)發(fā)育等方面進(jìn)行了分析，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供理論參考。目前取得以下一些初步結(jié)果，(1)利用Hs-SPME-GC-MS技術(shù)，通過檢索NIST質(zhì)譜庫，運(yùn)用色譜峰面積歸一化

3、法對(duì)四個(gè)品種水稻IR68011、TZRO、SN89366和汕優(yōu)63的揮發(fā)性化學(xué)成分及相對(duì)含量的分析結(jié)果表明，其主要揮發(fā)性成分為直鏈烷烴類化合物(17種)和倍半萜烯類化合物(5種)，另外還有少量酯類(2種)、醇類(1種)和酮類(1種)。其中TZRO揮發(fā)物中的倍半萜烯類化合物的含量最為豐富，含有β-倍半水芹烯(3.25％)、α-姜烯(3.01％)、α-香檸檬烯(1.7％)、α-姜黃烯(1.57％)、β-紅沒藥烯(1.48％)，而IR6801

4、1含有其中的α-姜烯(6.82％)和α-姜黃烯(2.4％)兩種倍半萜烯，不過IR68011中的姜烯含量是TZRO中的兩倍之多。本研究沒有在水稻揮發(fā)物中檢測(cè)到單萜烯化合物。 (2)對(duì)KOME數(shù)據(jù)庫中水稻的cDNA信息進(jìn)行BLAST搜索，并設(shè)計(jì)引物，抽提富含姜烯的水稻品系IR68011葉片的總RNA，通過RT-PCR擴(kuò)增得到兩條潛在姜烯合酶基因序列ZISl和ZIS2，測(cè)序結(jié)果顯示其ORF分別為1800 bp和1515 bp，利用基因

5、融合表達(dá)系統(tǒng)將得到的基因在大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行表達(dá)，并摸索優(yōu)化了原核表達(dá)條件，SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，目的基因獲得了大量表達(dá)，不過絕大多數(shù)原核表達(dá)蛋白均以無活性的包涵體形式存在，對(duì)后續(xù)的蛋白種類鑒定和活性測(cè)定帶來了一定困難。 (3)生物信息學(xué)分析表明，ZISl和ZIS2有著極為相似的堿基組成比例，ZISl的A:G:T:C=30:22.78:26.56:20.67，ZIS2的A:G:T:C=30.89:22.84:27

6、.13:19:14，兩者中A+T的含量均相對(duì)較多。ZISl編碼599 aa，ZIS2編碼504 aa，同樣ZISl和ZIS2也有著相似的氨基酸組成比例，含量最為豐富的氨基酸為L(zhǎng)eu，分別為10.18％和10.91％。 經(jīng)分析，ZISl和ZIS2均為親水性蛋白，均無導(dǎo)肽序列和信號(hào)肽序列，由導(dǎo)肽和信號(hào)肽的分析結(jié)果可推斷，其對(duì)應(yīng)的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中合成后，不進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)，而是留在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，直接與代謝底物作用。跨膜區(qū)域分析結(jié)果顯示．ZISl

7、和ZIS2均不含跨膜區(qū)，這也對(duì)導(dǎo)肽和信號(hào)肽的推測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，即二者在細(xì)胞質(zhì)中合成后，不進(jìn)行跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，直接在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中的特定部位發(fā)揮作用。氨基酸序列功能位點(diǎn)搜索結(jié)果顯示，ZISl含有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，1個(gè)環(huán)磷酸腺苷和環(huán)磷酸鳥苷相關(guān)的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，8個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，4個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，1個(gè)酰氨化位點(diǎn)；ZIS2含有1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)，7個(gè)

8、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)，2個(gè)N-肉豆蔻?；稽c(diǎn)，1個(gè)細(xì)胞附著位點(diǎn)。這些序列中功能位點(diǎn)的多樣性很好的說明了萜烯合酶功能的多樣性。對(duì)ZISl和ZIS2氨基酸序列的結(jié)構(gòu)功能域分析，發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)功能域，一個(gè)是N-terminal domain(PF01397)，該功能域?qū)儆谳葡┖厦讣易?TPS)所有，另一個(gè)為萜烯合酶結(jié)合金屬離子的功能域(PF03936)。氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示，α-螺旋和不規(guī)則卷曲是最大量的結(jié)

9、構(gòu)元件，在ZISl中分別占59.93％和28.21％，在ZIS2中分別占72.82％和18.65％，另外均有少量的β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈。 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了54條不同植物多種萜烯合酶的基因序列，對(duì)其進(jìn)行序列比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示ZISl和．ZIS2均含有萜烯合酶共有保守區(qū)DDXXD序列，并與單子葉植物水稻和玉米的倍半萜烯合酶的關(guān)系最為接近，同時(shí)結(jié)果也顯示，除個(gè)別序列外，總體上單萜烯合酶、倍半萜烯合酶和二萜烯合