雞骨鈣素酶聯(lián)免疫吸附法研制與不同因素對骨鈣素及骨代謝的影響.pdf

1、骨鈣素(osteocalcin，OC)主要由成骨細(xì)胞表達(dá)分泌，是骨骼中含量最多的非膠原蛋白，OC包含兩種形式:羧基化OC和非羧基化骨鈣素(undercarboxylatedosteocalcin，unOC)。絕大部分羧基化OC沉積在骨基質(zhì)中，一部分也被釋放入血液;在骨吸收增加時，破骨細(xì)胞分泌的酸性物質(zhì)使OC脫羧基，形成unOC，也分泌到血液中。因此，血液中含有羧基化OC和unOC。研究顯示血液中的OC是骨轉(zhuǎn)化的特異性標(biāo)志物，可用于評價骨

2、骼生長，檢測骨骼疾病。最新研究揭示，血中OC為一種內(nèi)分泌激素，可調(diào)節(jié)能量代謝。有關(guān)雞OC的研究鮮見報道，也缺乏方便快速檢測雞血液OC的方法。本試驗(yàn)成功地研制了雞OC原核表達(dá)蛋白、OC抗體及ELISA法，并研究了不同因素對OC及骨代謝的影響，探討了蛋雞OC與骨代謝及能量代謝的關(guān)系及其機(jī)理，其中制備的雞OC抗體及建立的ELISA法在研究中得到了充分應(yīng)用。
　　為研制OC抗體及ELISA法，本試驗(yàn)使用Trizol法提取雞額骨總RNA，應(yīng)

3、用RT-PCR技術(shù)克隆雞OC基因，獲得的目的片段與pMD18-Tsimplevector克隆載體連接，構(gòu)建pMD18-T-chOCⅠ重組質(zhì)粒，該重組質(zhì)粒經(jīng)亞克隆添加終止子TAG，獲得含有終止子TAG的pMD18-T-chOCⅡ重組質(zhì)粒。pMD18-T-chOCⅡ和pET-32a(+)表達(dá)載體分別被EcolⅠ和XholⅠ雙酶切后，連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a(+)-chOC，并通過測序鑒定克隆質(zhì)粒和表達(dá)質(zhì)粒的的正確性。將質(zhì)粒pET

4、-32a(+)-chOC轉(zhuǎn)化到Rosetta-gami(DE3)pLyS宿主菌，IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)出含His標(biāo)簽的重組蛋白(His-rchOC)，經(jīng)SDS-PAGE蛋白膠和Western-blotting鑒定蛋白是否正確表達(dá)。該蛋白使用His純化小柱純化后，腸激酶酶切去除融合蛋白中的His標(biāo)簽，獲得rchOC蛋白。通過檢測rchOC與羥基磷灰石結(jié)合性，及其對成骨細(xì)胞增殖和分化的影響，分析該蛋白的生物學(xué)活性。
　　以His-rchO

5、C重組蛋白為抗原，免疫4只雄性新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，根據(jù)間接競爭ELISA法原理制備雞血清OC檢測方法。鑒定該ELISA法的敏感性、準(zhǔn)確性及溶血和稀釋血清對該方法敏感性的影響，并使用該ELISA與商品化的鼠OCELISA試劑盒同時檢測棲木籠養(yǎng)對蛋雞血清OC的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證本方法的有效性和準(zhǔn)確性。
　　在成功地研制蛋雞OC抗體及ELISA法的基礎(chǔ)上，分別開展了蛋雞洋蔥日糧和高能低蛋白日糧試驗(yàn)，以探討不同因素對蛋雞OC、骨代

6、謝及能量代謝的影響。
　　一為蛋雞洋蔥日糧試驗(yàn)。48羽90周齡健康海南W36蛋雞隨機(jī)分成4組，每組12羽，每2羽飼喂在同一籠中，適應(yīng)性飼喂1周后，更換日糧，飼喂含有0％（對照）、3％（低）、6％（中）和10％（高）的洋蔥粉末飼料，持續(xù)飼喂4周。檢測第0、14及29d體重變化，檢測第7～9，19～21，27～29d采食量。在第29d，安樂處死所有蛋雞，采集血液，測定血清鈣、磷、堿性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶和OC含量。雙能X線檢測肱

7、骨、股骨和脛骨的骨密度、骨礦物含量、骨面積、骨長度和骨寬度。
　　二為高能低蛋白日糧試驗(yàn)。100羽海蘭褐殼蛋雞隨機(jī)分成兩組，每組50羽，每兩羽飼養(yǎng)在同一籠中，分別提供高能低蛋白日糧（highenergyandlowproteinprotein，HE-LP）和常規(guī)日糧（control）。適應(yīng)性飼喂1周后，更換試驗(yàn)日糧，繼續(xù)飼喂80d。記錄蛋雞產(chǎn)蛋率、采食量及體重。第80d，每組10羽放血處死。使用自動生化儀檢測血液中鈣、磷及堿性磷酸

8、酶含量。ELISA法檢測蛋雞OC、瘦素樣蛋白及雌激素含量。千分尺檢測脛骨長度和寬度。放射密度法檢測右側(cè)脛骨密度，萬能材料試驗(yàn)機(jī)檢測左側(cè)脛骨強(qiáng)度。Real-timePCR檢測龍骨骨骼中OC基因表達(dá)變化，Western-blotting檢測骨骼中OC蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果顯示，本試驗(yàn)使用RT-PCR法成功地?cái)U(kuò)增獲得含有148bp的chOC成熟肽基因，測序結(jié)果與GenBank報道的雞OC序列完全一致，成功構(gòu)建了pMD18-T-chOC

9、Ⅰ和pMD18-T-chOCⅡ克隆質(zhì)粒及pET-32a(+)-chOC表達(dá)質(zhì)粒。原核表達(dá)獲得的His-rchOC分子量約為26kD，與預(yù)期大小一致，能與His抗體結(jié)合。酶切后rchOC蛋白能與羥基磷灰石結(jié)合，抑制成骨細(xì)胞分化，但不影響成骨細(xì)胞的增殖。本試驗(yàn)成功表達(dá)His-rchOC蛋白，獲得rchOC蛋白具有生物學(xué)活性。使用His-rchOC制備的兔抗雞OC多克隆抗血清效價大于1∶107，OC多克隆血清經(jīng)純化后，獲得特異性雞OC多克隆抗

10、體。該抗體可應(yīng)用于Western-blotting檢測骨骼中OC表達(dá)量。研制雞OC間接競爭ELISA條件是:100μL1∶8000稀釋的包被抗原加入ELISA板中，4℃包被過夜;次日PBST洗板1次，10％脫脂奶粉封閉;PBST洗板1次，加入50μL1∶5000稀釋的抗體后和50μL標(biāo)準(zhǔn)品后不預(yù)混，直接加入洗滌好的包被板上，37℃孵育1h;棄去，PBST洗板5次，每次3min;加入100μL1∶11000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體，3

11、7℃孵育1h;棄去，PBST洗板5次，每次3min，加入100μLTMB底物顯色液，室溫孵育10min，2MH28O4終止反應(yīng)。本試驗(yàn)研制雞OCELISA的最低檢測下限是0.13ng·mL-1，批內(nèi)差異和批間差異分別是＜7％和＜12％，具有良好的敏感性、準(zhǔn)確性及精確性。溶血及稀釋血清將降低ELISA的敏感性。該方法與商品化鼠OCELISA試劑盒同時檢測雞血清OC含量，獲得的檢測值之間具有相關(guān)性(P＜0.0001)，且使用本方法檢測的血清

12、雞OC值比使用鼠OCELISA試劑盒獲得的檢測值高(P＜0.0001)。
　　與非棲木籠養(yǎng)比較，棲木籠養(yǎng)可提高產(chǎn)蛋蛋雞血清OC含量（P=0.04），而對生長期蛋雞無影響（P=0.15），可用于預(yù)測蛋雞骨質(zhì)疏松的發(fā)生。含有洋蔥的日糧未顯著性影響蛋雞體重和采食量，采食中劑量洋蔥日糧蛋雞產(chǎn)蛋量相對于采食低和高劑量洋蔥日糧蛋雞有增加的趨勢，且中劑量組蛋殼強(qiáng)度比低劑量組顯著增加（P=0.03）。洋蔥日糧對血液OC等骨生物學(xué)指標(biāo)無顯著影響。相

13、對于對照組，低劑量洋蔥組肱骨骨礦物含量、股骨面積及肱骨寬度有增加的趨勢，其他組無顯著差異。采食高能低蛋白日糧蛋雞產(chǎn)蛋率和采食量均低于對照組(P＜0.05)，體重、肝和腹部脂肪含量均比對照組高（P＜0.05）。血液OC、堿性磷酸酶、瘦素樣蛋白、雌激素均比對照組高(P＜0.05)。Western-blotting結(jié)果顯示，高能低蛋白組蛋雞龍骨OC含量降低(P＜0.05)。相關(guān)性分析顯示，血液中OC、瘦素樣蛋白及雌激素間呈顯著正相關(guān)。

14、　　結(jié)論:本試驗(yàn)成功構(gòu)建了pMD18-T-chOCⅠ和pMD18-T-chOCⅡ克隆質(zhì)粒和pET-32a(+)-chOC表達(dá)質(zhì)粒，表達(dá)出His-rchOC蛋白，獲得rchOC蛋白具有生物學(xué)活性。制備出雞OC多克隆抗體，并建立了雞OCELISA法。該抗體具有較高的效價和敏感性，可用于Western-blotting檢測骨骼中OC的含量。建立的ELISA法具有較好的敏感性、準(zhǔn)確性和精確性，可用于檢測雞血液OC的含量。棲木籠養(yǎng)環(huán)境可提高產(chǎn)蛋后