一些重要基因標簽單核苷酸多態(tài)性的篩選及其與創(chuàng)傷并發(fā)癥風險性的臨床多中心關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景：
　　 嚴重創(chuàng)傷是一個危害公共健康的世界性難題，已成為世界第四大常見死亡原因。嚴重創(chuàng)傷患者在傷后往往并發(fā)膿毒癥和多器官衰竭等嚴重并發(fā)癥，并導致最終死亡。對人類健康和社會經(jīng)濟發(fā)展已構(gòu)成巨大的負面影響，因而是目前全球范圍內(nèi)危重病醫(yī)學領(lǐng)域內(nèi)亟待解決的重大科學問題。雖然目前膿毒癥的治療方法眾多，但是膿毒癥的治療水平并無明顯的提高。膿毒癥雖然不是遺傳病，但是感染引發(fā)的炎癥反應是以機體內(nèi)眾多基因的表達變化為基礎(chǔ)的。膿毒癥表型和預后

2、的差異在很低程度上取決于炎癥反應的程度?，F(xiàn)已研究表明，基因組上的變異，即基因多態(tài)性是造成個體間感染反應差異性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。因此，從基因背景上深化研究感染引發(fā)炎癥反應的發(fā)生規(guī)律及其與膿毒癥風險性和預后的關(guān)系，不僅為進一步揭示膿毒癥的發(fā)病機制提供新的理論認識，更重要的是，這些新的研究技術(shù)將有可能從遺傳背景上準確判斷病人并發(fā)膿毒癥的風險性和預后，為膿毒癥病人個體化治療提供科學依據(jù)，同時基于功能性基因突變可研制出更有針對性的新的治療方法，甚至

3、有可能開創(chuàng)膿毒癥基因治療的新紀元。
　　 白細胞介素-10是T細胞輔助產(chǎn)生的以抑制Th1細胞克隆的細胞因子合成為特點的多效免疫調(diào)節(jié)因子。近年來白細胞介素-10在創(chuàng)傷后并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展過程的毒作用日益受到重視，一般認為嚴重創(chuàng)傷后機體白細胞介素-10合成和釋放水平顯著增加，與機體創(chuàng)傷后發(fā)生免疫功能麻痹有非常密切的關(guān)系。宿主免疫細胞表面模式識別受體是免疫系統(tǒng)感知病原菌入侵以及病原菌引起免疫反應的首要環(huán)節(jié)。脂多糖結(jié)合蛋白和髓樣分化蛋白2是

4、很重要的模式識別受體分子。脂多糖結(jié)合蛋白不僅在脂多糖的識別和革蘭氏陰性菌感染中有重要作用，在革蘭氏陽性菌的感染中也有重要作用。MD-2能通過改變TLR4 胞外區(qū)的構(gòu)型而增強其對LPS的親和力。高遷移率蛋白-1和其配體-糖基化終產(chǎn)物受體也是膿毒癥發(fā)生過程中的重要分子?；诖?，這些創(chuàng)傷后膿癥和多器官功能不全發(fā)生重要的重要基因的標簽單核苷酸多態(tài)性被作為研究對象，進行基因分型，統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)分析以及后續(xù)的體內(nèi)體外功能研究和臨床關(guān)聯(lián)研究。
　　

5、 材料與方法：1. 樣本。本研究收集了重慶和浙江兩個地區(qū)的嚴重創(chuàng)傷患者DNA 樣本。所有采集的樣本均為居住在中國的漢族人，相互間無血緣關(guān)系。重慶地區(qū)的樣本來自于2005年1月至2010年7月重慶市大坪醫(yī)院創(chuàng)傷中心和重慶市急救中心收集的患者血樣；浙江地區(qū)的樣本來自于2007年1月至2010年7月浙江大學第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷與急救中心收集的患者血樣?；颊呒{入標準為：(1)創(chuàng)傷后24小時內(nèi)；(2)ISS 評分≥16分；(3)年齡≥18歲且≤65

6、歲，性別不限；(4)存活時間超過1周。
　　 2.標簽單核苷酸多態(tài)性的篩選。LBP, HMGB1, RGAE和MD-2基因的轉(zhuǎn)錄起始位點上游3-10kb 至其終止子下游3-10kb 范圍及基因所有內(nèi)含子和外顯子范圍內(nèi)進行標簽單核苷酸多態(tài)性的篩選?；蚍中唾Y料來源于人類單體型圖計劃（HapMap，www.hapmap.org）的45例中國北京漢族人群。用Haploview 軟件構(gòu)建基因的單倍域，其標準是，若一段區(qū)域內(nèi)95％以上的S

7、NP 之間D’值的95％可信區(qū)間上限大于0.98，下限大于0.7，則說明該區(qū)域在遺傳上幾乎沒有發(fā)生重組，該組SNP構(gòu)成一個單倍域。利用Tagger 軟件在單倍域內(nèi)進行標簽單核苷酸多態(tài)性的篩選。
　　 3.基因分型。采用焦磷酸測序法對LBP，HMGB1，MD-2和RAGE基因進行標簽SNPs的分型。焦磷酸測序法是一個基于測序的可靠的SNP分型方法，按照儀器說明反應在28°C 進行，儀器根據(jù)每個堿基的峰高進行結(jié)果的自動判讀。采用RF

8、LP-PCR對白細胞介素-10基因進行分型?；蚍中徒Y(jié)果均通過隨機抽取10％進行第二次分型確認。
　　 4.細胞因子表達水平檢測：取嚴重創(chuàng)傷患者入院后第一天全血，37°C，100ng/mlLPS 刺激4小時后，離心收集血漿。用ELISA 方法檢測血漿細胞因子表達水平，方法參照試劑盒說明書。
　　 5.蛋白分子模建。殺菌性/通透性增加蛋白（BPI）與LBP蛋白有高度的同源性，以已知晶體結(jié)構(gòu)的BPI 結(jié)構(gòu)為模板，對LBP 進

9、行晶體結(jié)構(gòu)模建。通過幾何距離測量的方法，對氨基酸之間的距離，疏水口袋的面積和體積進行了分析。用Discover_3 模塊對范德華力進行計算。
　　 6.獲取重組人野生和突變LBP蛋白。以肝組織RNA 反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用PCR的擴增的方法獲得人LBP基因的cDNA 全長片段。將之插入pCI-neo 質(zhì)粒的EcoRIsite和XbaI 位點之間。用位點特異的點突變的方法獲得26877T→C 突變。重組質(zhì)粒送公司進行測序。用野

10、生和突變兩個質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細胞，收集轉(zhuǎn)染后24小時的上清進行人LBP ELISA 檢測，以確定LBP的表達水平。
　　 7.rs2232618對LPS 結(jié)合及轉(zhuǎn)運的影響。將Raw264.7細胞的上清更換為無血清培養(yǎng)基后，用200ng/ml的野生和突變LBP蛋白，100ng/ml LPS 或FITC-LPS 進行刺激，收集上清進行TNF-αELISA 檢測。PBS 清洗細胞后，進行熒光強度檢測。
　　 8. Rs22326

11、18對LBP與CD14 結(jié)合的影響。用ELISA的方法來檢測重組LBP蛋白與CD14的結(jié)合力。在酶標板上包被10μg/ml CD14蛋白。PBS 清洗5 遍后，用100ng/mlLPS與重組野生及突變LBP蛋白混合加入包被的孔中，37 °C 反應1小時。用山羊抗人LBP 一抗及辣根過氧化物酶標記的抗山羊的二抗來檢測與CD14 結(jié)合的LBP的量。酶標儀檢測每孔的OD值。
　　 9. Rs1800625 (-429T/C)對RAGE

12、基因啟動子活性的影響。為進一步明確-429T/C對RAGE 啟動子活性的影響，用PCR 方法以野生型DNA 樣本為模版，擴增RAGE啟動子-597～+26bp 片段，構(gòu)建pGL3BH-TT 質(zhì)粒。通過定點突變，構(gòu)建pGL3BH-CC質(zhì)粒。將兩種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染U-937細胞系，通過化學發(fā)光檢測儀觀察堿基改變對啟動子活性的影響。
　　 10. 臨床關(guān)聯(lián)研究：膿毒癥診斷標準：(1)有病原菌培養(yǎng)證據(jù)；(2)體溫高于38.5℃或低于36.5℃；

13、(3)白細胞計數(shù)高于10×109/L 或低于4×109/L。根據(jù)患者呼吸功能（氧合指數(shù)）、腎功能（血漿肌酐濃度）、肝功能（血漿膽紅素濃度）、心血管功能（血壓調(diào)整后心率）、凝血功能（血小板計數(shù)）和中樞神經(jīng)系統(tǒng)（格拉斯哥評分）等變化計數(shù)器官功能障礙評分。創(chuàng)傷ISS 評分采用簡明損傷定級標準(1998 版)。
　　 11. 統(tǒng)計分析：各SNP的等位基因型頻率由基因計數(shù)獲得。H-W平衡采用卡方檢驗計算。組間熒光素酶活性通過單因素方差分析

14、比較。多態(tài)性與MODS 評分、細胞因子表達水平間的關(guān)系采用單因素方差方法統(tǒng)計。等位計量效應采用線性回歸分析統(tǒng)計，并用年齡、性別及ISS 評分校正。顯性及隱性遺傳模式下各基因型與膿毒癥發(fā)生率之間的關(guān)系采用卡方檢驗方法統(tǒng)計。等位計量效應采用多重Logister 回歸分析計算，并對年齡、性別及ISS 評分校正。檢驗效能通過在線軟件Power and Sample Size Programsoftware (http://biostat.mc.

15、vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize)計算。
　　 結(jié)果：
　　 1.IL-10的-1082 位點與膿毒癥的發(fā)生密切相關(guān)，A等位基因攜帶者患創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs的幾率明顯增高。-1082A，-592A等位基因和ATA 單體型與低血漿IL-10水平有關(guān)；
　　 2.通過對重慶和浙江人群統(tǒng)計學關(guān)聯(lián)分析，我們發(fā)現(xiàn)LBP rs2232618 C等位基因攜帶

16、者患創(chuàng)傷后膿毒癥及MODs的幾率顯著高于T等位基因攜帶者。LBP蛋白第436位氨基酸是高度保守的，其由苯丙氨酸被亮氨酸替代以后可能導致LBP蛋白的C 端活性中心的結(jié)構(gòu)改變，突變后范德華能減小，導致分子構(gòu)型穩(wěn)定性減低，從而使疏水口袋變大，可能更容易與CD14 結(jié)合。轉(zhuǎn)染CHO細胞獲得野生和突變兩個蛋白，用重組蛋白進行LPS 結(jié)合和刺激實驗表明，突變蛋白刺激巨噬細胞后，細胞分泌TNF-α的水平顯著高于野生蛋白，且轉(zhuǎn)運LPS的能力也顯著高于野

17、生蛋白。我們用ELISA的方法直接檢測兩個重組蛋白與CD14蛋白的結(jié)合力大小的實驗顯示，突變蛋白與CD14結(jié)合能力明顯高于野生蛋白（P=0.043）。這表明，rs2232618 多態(tài)性可能通過影響LBP蛋白C 端活性中心的結(jié)構(gòu)從而影響了LBP蛋白與下游CD14分子的結(jié)合能力，突變LBP蛋白更易與CD14分子結(jié)合，使其傳遞LPS的能力增強，更易于激發(fā)炎癥反應。因此我們推斷，rs2232618不僅是一個影響LBP蛋白功能的重要多態(tài)性位點，也

18、是一個預警創(chuàng)傷后并發(fā)癥的分子標記。
　　 3.在HMGB1的3個標簽SNPs中，只有rs2249825與LPS 刺激血漿后HMGB1
　　 水平相關(guān)。Rs2249825是一個位于內(nèi)含子1的C→G 突變，會改變v-Myb 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，v-Myb是一個HMGB1表達的強的增強子（1）。與此一致的是，rs2249825與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs 發(fā)生密切相關(guān)。而另外2個標簽SNPs（rs1412125和rs1045411）不

19、影響患者創(chuàng)傷后的并發(fā)癥發(fā)生率。
　　 4．通過對重慶和浙江兩個地區(qū)創(chuàng)傷人群的關(guān)聯(lián)分析，MD-2的3個標簽SNPs中，只有rs11465996與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs的發(fā)生均密切相關(guān)。該結(jié)果與實驗室前期實驗結(jié)果一致（2），我們前期已證實，-1625C/G（rs11465996）是一個影響MD-2 啟動子活性的有功能的位點。
　　 5.RGAE基因rs1800625（-429T/C）是一個與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODs 發(fā)生密切相

20、關(guān)的位點，T等位基因攜帶者有更高的患病率。熒光報告基因?qū)嶒炞C實，-429C 會減弱RAGE 啟動子活性。
　　 結(jié)論：
　　 IL-10基因的-1082A/G，LPB基因的rs2232618，HMGB1基因的rs2249825，MD-2基因的rs11462996及RAGE基因的rs1800625 都是與創(chuàng)傷后膿毒癥和MODS 發(fā)生密切相關(guān)的多態(tài)性位點。LBP基因的rs2232618（Phe436Leu）是一個影響LBP蛋