海洋微生物鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因trkH的克隆與表達(dá).pdf

1、K+是植物及微生物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，廣泛分布于有機(jī)體內(nèi)，參與多種重要的生理過(guò)程。我國(guó)土壤普遍缺鉀，并伴有一定程度鹽漬化，細(xì)胞內(nèi)過(guò)多的Na+積累會(huì)產(chǎn)生毒性，因此維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定且較高K+含量和較低Na+含量至關(guān)重要。目前從植物中克隆得到的鉀吸收相關(guān)基因，大部分來(lái)自甜土植物，且對(duì)應(yīng)蛋白多數(shù)對(duì)Na+敏感，使之在高Na+環(huán)境下無(wú)法較好地行使K+吸收功能。已有研究證實(shí)，某些生存在富鹽環(huán)境的微生物，其K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在高Na+條件下仍有較高

2、K+吸收活性，這些蛋白是一類Trk家族的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。海洋是高鹽環(huán)境，海洋微生物中的K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白很可能具有這種Na+不敏感性。
　　本研究選用海洋微生物宏基因組DNA為實(shí)驗(yàn)材料，該宏基因組DNA包含所收集海水中幾乎所有微生物的遺傳信息。研究旨在從中獲得一種在高鹽環(huán)境下仍具有鉀吸收能力的Na+不敏感鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因。本研究克隆得到了鉀轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因trkH，其完整的ORF長(zhǎng)度為1392bp，可編碼一個(gè)含463個(gè)氨基酸的蛋白。生物信息分

3、析結(jié)果表明，該蛋白屬于TrkH超家族，且具有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，是典型的細(xì)菌TrkH家族鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。同源性比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果表明，TrkH的氨基酸序列和目前已驗(yàn)證功能的TrkH家族蛋白之間僅有22％-36％的同源性，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。構(gòu)建酵母表達(dá)載體pYES2.0-trkH，并以大腸桿菌的EctrkH作對(duì)照，在鉀吸收缺陷型酵母CY162中進(jìn)行功能探究。功能互補(bǔ)和K+耗竭實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在外界K+濃度為3mM時(shí)，海洋來(lái)源TrkH和大腸桿

4、菌EcTrkH在K+吸收功能上并無(wú)明顯差別;在不同K+/Na+濃度梯度下對(duì)轉(zhuǎn)化后酵母的生長(zhǎng)情況進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示TrkH是一個(gè)低親和K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，且初步表明在含有3mM K+和100mM Na+的培養(yǎng)條件下，TrkH比EcTrkH表現(xiàn)出更高的Na+不敏感性。本研究是該類基因首次在真核系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)并進(jìn)行功能探究。為進(jìn)一步研究其在植物中的功能，構(gòu)建植物表達(dá)載體并采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法將重組質(zhì)粒導(dǎo)入擬南芥使，通過(guò)Basta篩選和檢測(cè)獲得了