博爾納病病毒核蛋白調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞存活、增殖及分化的初步研究.pdf

1、背景與目的:
　　 神經(jīng)干細(xì)胞(Neural Stem Cells,NSCs)在體外培養(yǎng)體系中以神經(jīng)球的方式生長(zhǎng)增殖,而在干細(xì)胞研究中,許多實(shí)驗(yàn)方法都是針對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行的。將NSCs安全有效地單細(xì)胞化是實(shí)驗(yàn)中的必要步驟?，F(xiàn)有多種離散神經(jīng)球的方法,但在安全性或有效性方面存在各種缺陷,對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程造成困擾。本實(shí)驗(yàn)探討一種離散神經(jīng)球的安全有效的方法,為后繼實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、體外分離、培養(yǎng)新生24h內(nèi)

2、的Sprague-Dawley(SD)大鼠海馬源性NSCs并進(jìn)行NSCs的Nestin鑒定。
　　 2、實(shí)驗(yàn)設(shè)立以下4組(1)胰酶消化組:未控制神經(jīng)球體積,離散時(shí)胰酶消化30min;(2)單純吹打組:未控制神經(jīng)球體積,離散時(shí)僅用巴斯德吸管吹打;(3)濾網(wǎng)研磨組:未控制神經(jīng)球體積,離散時(shí)采用不銹鋼濾網(wǎng)研磨;(4)控制神經(jīng)球體積結(jié)合胰酶短時(shí)消化組:對(duì)神經(jīng)球體積加以控制,離散時(shí)胰酶短時(shí)消化。
　　 3、分別在離散后5min及離

3、散后1d,觀察各組神經(jīng)球單細(xì)胞化效果及NSCs生長(zhǎng)情況。
　　 4、分別在離散后5min及離散后1d,對(duì)各組細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算細(xì)胞存活率。
　　 結(jié)果:
　　 胰酶消化較長(zhǎng)時(shí)間(＞30min)可以得到大量單細(xì)胞但是難以存活;單純巴斯德吸管吹打離散神經(jīng)球效果差;不銹鋼濾網(wǎng)研磨對(duì)細(xì)胞損傷大,導(dǎo)致細(xì)胞存活率低下;而采用控制神經(jīng)球體積結(jié)合胰酶短時(shí)消化可以獲得大量單細(xì)胞并且細(xì)胞存活率明顯較高(離散后5min9

4、2.2％和離散后1d82.0%,p＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 控制神經(jīng)球體積(直徑約50μm左右)結(jié)合胰酶短時(shí)(約5min左右)消化法是離散神經(jīng)球的一種安全有效的方法。
　　 背景與目的:
　　 博爾納病病毒((Borna Disease Virus,BDV)是一種具有高度嗜神經(jīng)性的病毒。近年,有大量研究發(fā)現(xiàn)該病毒感染與人類(lèi)神經(jīng)精神疾病包括抑郁癥的發(fā)生有關(guān)。但其確切機(jī)制仍未明了。核蛋白是BDV的主

5、要蛋白之一,由p40基因片段編碼,在細(xì)胞中含量最豐富、變異程度最小。一些研究顯示ERK1/2信號(hào)通路在NSCs的存活、增殖和分化中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)用含有博爾納病病毒核蛋白(BDV p40)基因的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-p40轉(zhuǎn)染新生24h內(nèi)SD大鼠海馬源性NSCs,觀察其增殖、存活及分化的改變,以及對(duì)NSCs ERK1/2信號(hào)通路的影響,試圖了解BDV p40對(duì)NSCs的作用,從而揭示BDV引起神經(jīng)精神疾病的部分發(fā)病機(jī)制。
　

6、　 方法:
　　 1、用陽(yáng)離子脂質(zhì)體法將pEGFP-N1-p40及pEGFP-N1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到NSCs中,在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率,用RT-PCR鑒定BDV p40在NSCs中的表達(dá),
　　 2、實(shí)驗(yàn)設(shè)置3組:未轉(zhuǎn)染組、pEGFP-N1空轉(zhuǎn)組及pEGFP-N1-p40轉(zhuǎn)染組,用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活的改變,用BrdU攝入實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖的改變,并經(jīng)免疫組化檢測(cè)轉(zhuǎn)染后14d細(xì)胞貼壁分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少

7、突膠質(zhì)細(xì)胞的比例變化。用Western Blot檢測(cè)ERK1/2磷酸化的改變。
　　 結(jié)果
　　 1、成功建立表達(dá)BDV p40的NSCs模型。在熒光顯微鏡下觀察到pEGFP-N1空轉(zhuǎn)組和pEGFP-N1-p40轉(zhuǎn)染組約10%NSCs在胞漿和/或胞核可見(jiàn)綠色熒光,未轉(zhuǎn)染組無(wú)綠色熒光表達(dá);PCR結(jié)果顯示只有pEGFP-N1-p40轉(zhuǎn)染組細(xì)胞有BDV p40基因表達(dá),而pEGFP-N1對(duì)照組及未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)均未見(jiàn)表達(dá)。

8、>　　 2、(1)BDV p40抑制NSC S的存活。(2)BDV p40抑制NSCs的增殖。(3)在轉(zhuǎn)染后貼壁分化14d時(shí)3組細(xì)胞分化為神經(jīng)元、星型膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞的比例未見(jiàn)顯著差異。(4)Western Blot結(jié)果顯示BDV p40下調(diào)了磷酸化ERK1/2在蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 BDV p40抑制NSCs的存活、增殖,但是對(duì)NSCs的分化方向沒(méi)有明顯的影響。BDV p40有可能通過(guò)下調(diào)磷酸化