CD8+T淋巴細胞在大鼠缺血—再灌注腦組織中表達的變化.pdf

1、目的:
　　 采用免疫組織化學染色方法，運用大鼠大腦中動脈閉塞(middlecerebralarteryocclusion，MCAO)腦缺血模型，通過觀察再灌注不同時間點缺血-再灌注組織CD8+T細胞表達的動態(tài)變化，探討CD8+T細胞與缺血性腦損傷的關(guān)系。
　　 方法:
　　 健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠35只，體重250-300g，按隨機原則分為假手術(shù)組，缺血再灌注24小時、3天、5天、

2、7天、10天和14天組，每組5只。模型組參照Zea-Longa線栓法制作大鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)腦缺血模型。假手術(shù)組大鼠僅不插入線栓，其他操作同模型組。等待大鼠麻醉蘇醒，于蘇醒后24小時內(nèi)按照Zea-Longa5分制評分法對其進行神經(jīng)功能缺損評分，評分為1-3分的大鼠判定為造模成功，記錄入選大鼠的分數(shù)。各組達再灌注時間點后（假手術(shù)組術(shù)后1天）斷頸取腦，自腦前極始每2-2.5mm冠狀切片，置入4％多聚甲醛液中外固定（至少24小時），

3、避光保存。取固定好的組織，經(jīng)流水過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸臘（62度）和包埋過程，應(yīng)用石蠟切片機每個蠟塊連續(xù)切片3張，厚度4um制成石蠟切片。采用HE染色顯示缺血-再灌注組織病理學形態(tài);SP法免疫組織化學染色顯示CD8分子表達的空間分布和時間變化，200倍光鏡下每張切片目標區(qū)域（主要為缺血皮質(zhì)）隨機選取5個不重疊視野分別計數(shù)陽性細胞（陽性細胞的特征為胞膜棕黃染色），5個視野的平均值為該片陽性細胞計數(shù)結(jié)果。數(shù)碼相機鏡下拍照。

4、>　　 結(jié)果:
　　 1.缺血-再灌注腦組織病理學觀察:假手術(shù)組為正常腦組織，組織內(nèi)細胞排列層次分明，神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常。缺血-再灌注3天時缺血皮質(zhì)組織結(jié)構(gòu)紊亂，增厚，淡染，大量神經(jīng)元水腫變性;再灌注7天時，缺血皮質(zhì)中形態(tài)正常的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，大量神經(jīng)元胞質(zhì)胞核界限模糊、核固縮溶解，同時細胞間出現(xiàn)大小不等的空泡。中心壞死區(qū)出現(xiàn)大量空泡，呈蜂窩狀，神經(jīng)細胞少見;再灌注10天表現(xiàn)與7天相似。再灌注14天時缺血皮質(zhì)

5、空泡數(shù)量大量增加，壞死組織軟化被清除。
　　 2.免疫組化觀察CD8+細胞分布:假手術(shù)組幾乎無陽性表達。腦缺血再灌注24小時，缺血皮質(zhì)即可觀察到少量的CD8+細胞;再灌注3天時眾多CD8+細胞彌漫分布于皮質(zhì)梗死區(qū)缺血半暗帶，細胞呈類圓形，大小略有差別，部分陽性細胞聚集在血管周圍。隨著時間的延長，CD8+細胞數(shù)量逐漸增加，再灌注7-10天時最多，且表達部位逐漸轉(zhuǎn)移到中心壞死區(qū);再灌注14天時略有下降。
　　 3.高倍鏡下C

6、D8陽性細胞計數(shù):假手術(shù)組為2.2±0.5個/HP;缺血再灌注24小時，3天，5天，7天，10天和14天組分別為6.4±1.6個/HP，18.5±1.1個/HP，21.8±2.3個/HP，26.4±1.8個/HP，25.9±2.2個/HP和23.7±1.2個/HP。各模型組陽性細胞數(shù)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.CD8+T細胞于缺血-再灌注24小時即開始表達，7-10天達到高峰，隨后下降;<