表達(dá)GFP或BTV結(jié)構(gòu)蛋白的小反芻獸疫疫苗株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants)和藍(lán)舌病(Bluetongue)是嚴(yán)重危害山羊、綿羊等家養(yǎng)及野生反芻動(dòng)物的烈性傳染性疾病;分別由小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)和藍(lán)舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的病毒病。迄今為止，PPR和BT無特效藥，只能通過疫苗接種進(jìn)行防治。
　　 反向遺傳操作作為病毒學(xué)技術(shù)，可利用該技術(shù)開

2、展RNA病毒各方面的研究，特別是將RNA病毒開發(fā)成病毒載體用于研發(fā)新型疫苗。曾有PPRV迷你基因組建立的報(bào)道，證明了PPRV反向遺傳操作系統(tǒng)建立的可行性，但此后一直未見PPRV成功救獲的報(bào)道，這嚴(yán)重阻礙了PPRV毒力機(jī)制、重組載體疫苗開發(fā)等方面的研究進(jìn)展。為了能夠區(qū)分PPR自然感染和免疫感染并有效的對(duì)PPR進(jìn)行防控，本研究采用反向遺傳操作技術(shù)，構(gòu)建了表達(dá)兩種不同形式的GFP標(biāo)記疫苗，并以此為基礎(chǔ)優(yōu)化病毒中和試驗(yàn);同時(shí)構(gòu)建了表達(dá)我國12型

3、藍(lán)舌病病毒結(jié)構(gòu)蛋白的PPRV全長cDNA并進(jìn)行體外拯救，對(duì)獲救的重組病毒生物學(xué)特性進(jìn)行分析而開展了系列研究:
　　 試驗(yàn)Ⅰ.表達(dá)GFP的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　 本研究根據(jù)PPRV Nigeria75/1疫苗株構(gòu)建了的感染性全長cDNA，以此為基礎(chǔ)，構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的全長cDNA克隆。將插有GFP基因的全長cDNA(4μg/孔)克隆及三個(gè)輔助質(zhì)粒pCA-N(2μg

4、/孔)、pCA-P(1μg/孔)和pCA-L(1μg/孔)采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞內(nèi)，救獲病毒命名為rPPRV/GFP，首次拯救出了表達(dá)外源基因的PPRV重組病毒。該重組病毒在Vero細(xì)胞上的多步動(dòng)力學(xué)生長曲線與親本毒株相似，其最高生長滴度可達(dá)107.4TCID50/mL;經(jīng)間接免疫熒光(IFA)及蛋白免疫印跡(Western-blot)分析得知，重組病毒在Vero細(xì)胞上不僅能夠表達(dá)病毒自身抗原，也能夠表達(dá)GFP抗原;同時(shí)，將重

5、組病毒在Vero細(xì)胞上多次傳代，通過對(duì)傳代病毒的毒價(jià)滴定及GFP熒光強(qiáng)度的定量分析可知，重組病毒在傳代過程中依然能夠穩(wěn)定復(fù)制增殖并穩(wěn)定表達(dá)外源蛋白。rPPRV/GFP和wtPPRV/N75/1按103 TCID50的劑量各免疫山羊(0.5～1.5歲)4只，同時(shí)設(shè)置PBS注射的對(duì)照組(4只)，于免疫前及免疫后第2、4、6周采血進(jìn)行PPRV中和抗體檢測，兩個(gè)毒株免疫的所有羊的PPRV中和抗體效價(jià)在免疫2周后全部轉(zhuǎn)陽性(＞10)，在6周內(nèi)，兩

6、者抗體水平都基本維持不變。與wtPPRV/N75/1的效價(jià)比較，用GraphPad Prism軟件進(jìn)行2way ANOVA分析，二者差異不顯著(P＞0.05)。結(jié)果表明重組毒株保持了親本毒株的免疫原性，在P和M基因之間插入外源基因并未影響到親本毒株的免疫原性。
　　 試驗(yàn)Ⅱ.表達(dá)錨定型GFP的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　 傳統(tǒng)的弱毒疫苗株免疫后，不能通過血清學(xué)方法區(qū)分PPR自然感染和

7、免疫感染。本研究在選用GFP作為標(biāo)記蛋白的基礎(chǔ)上對(duì)其進(jìn)行修飾，使其N端具有組織纖維蛋白溶酶抗原(tPA)的信號(hào)肽(SIG)，C端具有H3N2型流感病毒HA蛋白跨膜錨定序列(ANC)，之后構(gòu)建出一株表達(dá)該錨定型GFP基因的小反芻獸疫病毒的全長cDNA克隆，該克隆連同三個(gè)輔助質(zhì)粒一起經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)進(jìn)Vero細(xì)胞內(nèi)，獲得重組病毒并命名為rPPRV/GFP-SA。該重組病毒保持了親本毒株的生長學(xué)特性，在Vero細(xì)胞上的多步動(dòng)力學(xué)生長曲線與親本

8、毒株相似，第5d病毒滴度可達(dá)峰值108.34 TCID50/mL;經(jīng)間接免疫熒光(IFA)及蛋白免疫印跡(Western-blot)分析可知，重組病毒在Vero細(xì)胞上不僅能夠表達(dá)自身病毒抗原，也能夠表達(dá)修飾后的GFP抗原。通過激光共聚焦觀測，修飾后的GFP成功的錨定在Vero細(xì)胞膜上，細(xì)胞內(nèi)殘留極少;而相應(yīng)的未修飾的GFP則積聚在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，未能錨定在細(xì)胞膜上。rPPRV/GFP和rPPRV/GFP-SA按105 TCID50的劑

9、量免疫2組(每組5只)0.5～1.5歲綿羊，間隔3周，相同劑量加強(qiáng)免疫1次，并于免疫前、一免3周及二免2周采血進(jìn)行抗體分析。兩組羊在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)所測PPRV抗體，用GraphPad Prism軟件進(jìn)行2way ANOVA分析，二者差異不顯著(P＞0.05)。但是rPPRV/GFP-SA免疫的羊的PPRV抗體水平與GFP抗體水平一定程度上呈正相關(guān)關(guān)系，其PPRV抗體效價(jià)高，對(duì)應(yīng)的血清中就能檢測到GFP抗體，可能是因?yàn)轭i部皮下免疫過程中存在扎

10、穿皮膚的情況而導(dǎo)致免疫失敗，待重新進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)驗(yàn)證。而rPPRV/GFP幾乎不能誘導(dǎo)GFP抗體的產(chǎn)生，僅有1472一免后產(chǎn)生了GFP抗體但很快下降。
　　 試驗(yàn)Ⅲ.表達(dá)12型BTV結(jié)構(gòu)蛋白的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株的構(gòu)建及生物學(xué)特性研究
　　 藍(lán)舌病病毒的VP2蛋白是誘導(dǎo)BTV保護(hù)性中和抗體的主要免疫原，VP5蛋白雖然不然誘導(dǎo)病毒產(chǎn)生中和抗體，但是可以協(xié)助VP2蛋白產(chǎn)生更高水平的中和抗體;VP3、VP7蛋白

11、構(gòu)成病毒內(nèi)衣殼，VP7蛋白可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性的反應(yīng);同時(shí)，VP2、VP5和VP7蛋白上有CTL表位。
　　 本研究成功構(gòu)建了分別表達(dá)我國12型藍(lán)舌病病毒分離株的VP2、VP3、VP5和VP7基因的全長cDNA克隆，將4個(gè)全長cDNA分別與三個(gè)輔助質(zhì)粒按照4∶2∶1∶1的比例混合后，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法將混合物轉(zhuǎn)入Vero細(xì)胞內(nèi)，體外成功拯救出重組病毒rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/BTV12-VP7。兩個(gè)重組病毒能

12、夠穩(wěn)定的復(fù)制增殖，在Vero細(xì)胞上的生長動(dòng)力學(xué)曲線與親本毒株相似;同時(shí)，經(jīng)間接免疫熒光(IFA)及免疫印跡(Western-blot)分析，獲救病毒在Vero內(nèi)可以表達(dá)出VP5和VP7蛋白。rPPRV/BTV12-VP5和wtPPRV/N75/1按107 TCID50的劑量各免疫5只山羊(0.5～1.5歲)，同時(shí)設(shè)置PBS注射的對(duì)照組(5只)，3周后相同劑量加強(qiáng)免疫1次，于免疫前、一免3周和二免2周后采血進(jìn)行中和抗體分析，所有羊在一免3

13、周全部轉(zhuǎn)陽(≥82.5)，二免2周抗體上升(≥325.5)，結(jié)果表明重組病毒和親本毒株一樣可以誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生高水平的PPRV保護(hù)性中和抗體，用GraphPad Prism軟件進(jìn)行2way ANOVA分析，二者差異不顯著(P＞0.05)，但是在山羊體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的VP5抗體水平不高。研究結(jié)果表明，rPPRV/BTV12-VP5保持Nigeria75/1弱毒疫苗株生物學(xué)特性、免疫學(xué)特性，可以有效的表達(dá)VP5蛋白但是卻不能有效的誘導(dǎo)動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)

14、生針對(duì)VP5蛋白的抗體，這可能和VP5蛋白自身免疫原性有關(guān)。由于時(shí)間關(guān)系，表達(dá)VP7蛋白的重組病毒未能進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)，同時(shí)構(gòu)建的表達(dá)VP2和VP3基因的PPRV全長cDNA可能因?yàn)椴迦胪庠椿蛱L或其他原因至今尚未拯救出重組病毒。但是重組病毒rPPRV/BTV12-VP5和rPPRV/BTV12-VP7的成功拯救，為將來研發(fā)安全有效的藍(lán)舌病及小反芻獸疫重組二聯(lián)活疫苗奠定了基礎(chǔ)。
　　 試驗(yàn)Ⅳ.表達(dá)GFP的重組小反芻獸疫病毒在病毒中

15、和試驗(yàn)中的應(yīng)用
　　 有效的診斷方法是PPR防控及疫苗效率檢測的重要措施之一，病毒中和試驗(yàn)(VNT)作為黃金標(biāo)準(zhǔn)被OIE推薦，該方法靈敏、特異、結(jié)果可靠，但缺點(diǎn)是太耗時(shí)，而且CPE結(jié)果的觀察需要有經(jīng)驗(yàn)人士進(jìn)行觀察，特別是在低濃度稀釋血清時(shí)，我們無法區(qū)分是血清內(nèi)的可能存在的有毒物質(zhì)導(dǎo)致還是病毒引起的細(xì)胞死亡。本研究在傳統(tǒng)的VNT的基礎(chǔ)上，用rPPRV/GFP替代wtPPRV/N75/1，首先選擇1份PPRV抗體陽性血清進(jìn)行分析，采

16、用rPPRV/GFP作為檢測抗原的VNT，其結(jié)果通過觀察感染的Vero細(xì)胞發(fā)出的熒光即可，取代了觀察CPE，有效避免了在觀測結(jié)果時(shí)的觀察者主觀性的影響，同時(shí)確定了優(yōu)化后的VNT結(jié)果統(tǒng)計(jì)的最佳時(shí)間為第6d。隨后隨機(jī)挑選出rCPV-PPRVH免疫的山羊、綿羊血清各10份，以及wtPPRV/N75/1免疫的山羊血清10份，采用兩種VNT方法檢測這30份血清的PPRV抗體，二種檢測方法所獲得抗體效價(jià)經(jīng)T-test分析后，P＞0.05，差異不顯著