小反芻獸疫新型快速實(shí)用檢測(cè)方法的建立及評(píng)估.pdf

1、小反芻獸疫(Peste des petits ruminants，PPR)是由副黏病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des petits ruminants virus，PPRV)引起的一種急性接觸性和高度致死性的烈性傳染病。其特征是發(fā)熱急、高熱稽留、口炎、腹瀉和肺炎。對(duì)綿羊、山羊等小反芻動(dòng)物危害嚴(yán)重，山羊發(fā)病嚴(yán)重，易感羊群的發(fā)病率和死亡率可達(dá)100％，野生動(dòng)物也可感染。是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列出的通報(bào)(notifia

2、ble)疫病，也是我國(guó)農(nóng)業(yè)部《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中的一類動(dòng)物疫病。此病1942年首先在非洲的科特迪瓦發(fā)生，目前在全球70多個(gè)國(guó)家流行，包括中東、非洲和亞洲大部，是一種跨境動(dòng)物傳染病，對(duì)發(fā)展中國(guó)家畜牧生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的影響。鑒于PPR目前在全球的傳播形勢(shì)，2015年OIE與世界糧農(nóng)組織(FAO)正式啟動(dòng)了PPRV根除計(jì)劃(GCES)，計(jì)劃于2030年前全球根除PPR。我國(guó)于2007年7月首次在西藏阿里地區(qū)暴發(fā)PPR疫情，自201

3、3年11月起小反芻獸疫在我國(guó)多個(gè)省市地區(qū)連續(xù)發(fā)生，疫情傳播快、跨度大、風(fēng)險(xiǎn)高，為此，農(nóng)業(yè)部于2015年12月印發(fā)了《全國(guó)小反芻獸疫消滅計(jì)劃（2016-2020年）》，對(duì)國(guó)內(nèi)該病的防控工作提出了新的要求。
　　基于2010年人類實(shí)現(xiàn)牛瘟全球根除的成功經(jīng)驗(yàn)，敏感快速的診斷方法對(duì)于PPR的防控及根除至關(guān)重要。傳統(tǒng)診斷方法如病毒分離、血清中和試驗(yàn)、瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)等，或費(fèi)時(shí)費(fèi)力，或特異性和敏感性不高;新型診斷方法如RT-PCR、熒光定量R

4、T-PCR等試驗(yàn)，雖然較為快速敏感，但需要特殊設(shè)備且只能由專業(yè)技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室中完成，不能滿足基層實(shí)驗(yàn)室或臨床現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。為實(shí)現(xiàn)2018年，全國(guó)所有免疫省份達(dá)到免疫無(wú)小反芻獸疫區(qū)的要求，實(shí)驗(yàn)室或基層現(xiàn)場(chǎng)一方面需要對(duì)大批量免疫動(dòng)物進(jìn)行快速特異性診斷、及時(shí)評(píng)價(jià)免疫效果，另一方面由于國(guó)內(nèi)PPRV弱毒活疫苗(Nigeria75/1株)的使用，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中難以區(qū)分疫苗株和野毒株，不利于PPR疫情的流行病學(xué)調(diào)查及最后階段的防控根除。為此，本

5、研究針對(duì)上述實(shí)際工作需求，探索建立了一套適用于基層根除防控的實(shí)用快速檢測(cè)方法，包括第一步在臨床現(xiàn)場(chǎng)對(duì)PPRV免疫后效果進(jìn)行快速評(píng)估(Post vaccination evaluaton，PVE)，其次在實(shí)驗(yàn)室對(duì)感染情況進(jìn)一步進(jìn)行血清學(xué)篩查（流行病學(xué)調(diào)查），如果發(fā)現(xiàn)PPRV感染，則對(duì)PPRV疫苗株及野毒株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室鑒別診斷(Differentiation of infected andvaccinated animals，DIVA)，通過(guò)

6、上述檢測(cè)，掌握免疫情況及感染狀況，為下一步的防控措施提供科學(xué)依據(jù)，是小反芻獸疫最終實(shí)現(xiàn)凈化根除檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用型研究。具體研究?jī)?nèi)容包括:
　　1.小反芻獸疫血清抗體超敏熒光量子點(diǎn)免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)(QDs-LFIAS)的建立及評(píng)估
　　使用水溶性羧基功能化量子點(diǎn)(QDs)作為熒光標(biāo)記，通過(guò)酰胺鍵與鏈球菌G蛋白(SPG)共軛，經(jīng)QDs標(biāo)記的SPG與PPRV抗體(IgG)結(jié)合，再與檢測(cè)線上的昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)的AcNPV-PPRV

7、-N重組蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)，在365nm的紫外線激發(fā)光下可見(jiàn)高亮的熒光帶，建立了檢測(cè)PPRV血清抗體的新型超敏熒光量子點(diǎn)免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)（QDs-LFIAS）。該方法抗體濃度與熒光強(qiáng)度直接關(guān)聯(lián)，使用成本低廉、維護(hù)保養(yǎng)簡(jiǎn)單的儀器在15min內(nèi)讀取結(jié)果。評(píng)估其分析敏感性（AnalyticalSensitivity，ASe）明顯優(yōu)于競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法(Competitive ELISA，C-ELISA)(OIE推薦的血清學(xué)檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn))及

8、膠體金免疫層析技術(shù)(Immunochromatographic StripICS)。檢測(cè)藍(lán)舌病、犬瘟熱、羊痘及口蹄疫病毒陰性，分析特異性(AnalyticalSpecificity, ASp)100％。與C-ELISA檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)臨床樣本，評(píng)估其診斷特異性（Diagnostic Specificity，DSp）及敏感性(Diagnostic Sensitivity，DSe)分別為99.47％和97.67％，一致性良好，適用于臨床現(xiàn)場(chǎng)

9、對(duì)小反芻獸疫的免疫效果進(jìn)行快速評(píng)價(jià)(PVE)。
　　2.小反芻獸疫病毒雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)快速檢測(cè)方法的建立及評(píng)估
　　利用免疫雜交瘤細(xì)胞技術(shù)，篩選獲得穩(wěn)定分泌PPRV單克隆抗體(MonoclonialAntibody，MAb)的雜交瘤細(xì)胞株(5B11)，利用該細(xì)胞株產(chǎn)生的針對(duì)PPRVN抗原的特異性MAb以及PPRV疫苗株全病毒免疫蛋雞獲取的PPRV特異性雞卵黃免疫球蛋白(eggyolk immunog

10、lobulin，IgY)，建立了檢測(cè)血清中PPRV抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS-ELISA)新型快速實(shí)用檢測(cè)方法。評(píng)估其分析特異性(ASp)結(jié)果顯示，該方法檢測(cè)PPRV陽(yáng)性樣品結(jié)果為陽(yáng)性，檢測(cè)藍(lán)舌病病毒、鹿流行性出血病病毒、水皰性口炎病毒、赤羽病病毒、口蹄疫病毒為陰性，特異性100％。與RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)臨床樣品，評(píng)估其DSp和DSe分別為99.2％和93.9％，兩種方法檢測(cè)結(jié)果的符合率為98.1％。重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果批內(nèi)變異系

11、數(shù)在2.14％～6.18％之間，批間變異系數(shù)在4.82％～8.37％之間，表明建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法重復(fù)性良好，適用于對(duì)小反芻獸疫免疫帶毒或野毒感染情況進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室快速血清學(xué)篩查及流行病學(xué)調(diào)查。
　　3.區(qū)分小反芻獸疫疫苗株與野毒株的實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR鑒別診斷方法的建立及評(píng)估
　　對(duì)我國(guó)西藏地區(qū)使用的PPRV弱毒活疫苗毒株(Nigeria75/1)進(jìn)行全基因組序列測(cè)定，分析比較已報(bào)道的PPR西藏野毒株的基因組

12、核酸序列，選擇兩者差異較大的特異區(qū)段設(shè)計(jì)了2套實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的引物和TaqMan探針?lè)謩e用于檢測(cè)PPRV疫苗株和野毒株，篩選最佳的引物、探針濃度，優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，針對(duì)我國(guó)PPRV防控實(shí)際需要，建立了區(qū)分小反芻獸疫活疫苗株與野毒株(differentiation of infected and vaccinated animals，DIVA)的新型實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR快速鑒別診斷方法。特異性分析結(jié)果顯示，檢測(cè)疫苗株的熒光RT

13、-PCR只能檢測(cè)到PPR疫苗毒株，檢測(cè)對(duì)照病毒及PPR野毒株均為陰性;檢測(cè)野毒株的熒光RT-PCR只能檢測(cè)到PPR野毒株，檢測(cè)對(duì)照病毒及PPR疫苗株均為陰性，說(shuō)明建立的上述鑒別診斷方法特異性強(qiáng)。靈敏度(Limit of detection，LOD)分析表明，檢測(cè)疫苗株的熒光RT-PCR最低檢出核酸數(shù)量級(jí)為1.38pg/μL，檢測(cè)野毒株的熒光RT-PCR最低檢出核酸數(shù)量級(jí)為0.16pg/μL，適用于我國(guó)目前防控PPRV對(duì)PPRV感染動(dòng)物及