腎上腺髓質(zhì)素(ADM)對(duì)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制.pdf

1、目的：以大鼠近端腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)缺氧復(fù)氧(H／R)模型模擬在體缺血再灌注損傷(IRI),通過轉(zhuǎn)染ADM真核表達(dá)質(zhì)粒,探討腎上腺髓質(zhì)素(ADM)對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制。
　　 方法：(1)正常培養(yǎng)的NRK-52E細(xì)胞,隨機(jī)分為四組:正常對(duì)照組、缺氧復(fù)氧(H／R)組、H／R+轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組、H／R+轉(zhuǎn)染ADM質(zhì)粒組。(2)應(yīng)用FugeneHD轉(zhuǎn)染試劑,將pcDNA3.1／myc-hisB質(zhì)粒和ADM真核表達(dá)質(zhì)粒分別

2、轉(zhuǎn)染至NRK-52E細(xì)胞內(nèi),48h后制作腎臟H／R模型。(3)利用三氣培養(yǎng)箱調(diào)整氮?dú)鈮毫π纬扇毖鯒l件,缺氧1h,復(fù)氧1.5h后臺(tái)盼藍(lán)攝取法進(jìn)行NRK-52E活細(xì)胞計(jì)數(shù)并計(jì)算細(xì)胞存活率,分光光度法檢測培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)評(píng)價(jià)細(xì)胞活力；(4)AnnexinV和PI染色結(jié)合流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測細(xì)胞凋亡；半定量反轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法檢測ADM、Bax、Bcl-2、Fas的mRNA表達(dá)；Western印跡法檢測半胱氨酸天冬

3、氨酸蛋白酶3、8、9(Caspase-3、8、9)的蛋白質(zhì)表達(dá)。
　　 結(jié)果：1)ADM的mRNA表達(dá)變化:與對(duì)照組相比,H／R組ADM的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),與H／R組相比,轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒ADM的表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；2)活細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞存活率及LDH含量:H／R組活細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著下降(P<0.05),LDH含量顯著升高(P<0.05),轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組活細(xì)胞計(jì)數(shù)和細(xì)胞存活率較H／R組顯著升高(P

4、<0.05),LDH含量顯著下降(P<0.05)；3)內(nèi)源性通路指標(biāo):與對(duì)照組相比,H／R組Bax、Bcl-2、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)均明顯上調(diào)(P<0.05),但Bax上調(diào)更為顯著,故Bax／Bcl-2升高(P<0.05),與H／R組相比,轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組Bax、Caspase-3和Caspase-9表達(dá)下調(diào)(P<0.05),Bcl-2表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)(P<0.05),Bax／Bcl-2降低(P<0.05)。4)外源性

5、通路指標(biāo):與對(duì)照組相比,H／R組Fas和Caspase-8表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05),與H／R組相比,轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組Fas和Caspase-8表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。5)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:H／R組NRK-52E細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組(12.71％±1.38％vs1.39％±0.68％,p<0.01)。轉(zhuǎn)ADM質(zhì)粒組細(xì)胞凋亡率則較H／R組(3.84％±0.97％vs12.71％±1.38％)顯著下降(P<0.05)。轉(zhuǎn)空質(zhì)