槐杞黃抗腎間質(zhì)纖維化的治療作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分槐杞黃抗UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的療效觀察
　　目的：觀察槐杞黃清膏對(duì)UUO模型大鼠腎間質(zhì)病理?yè)p傷的影響。
　　方法：建立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）腎間質(zhì)纖維化模型。將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為假手術(shù)組，UUO模型組，低、中、高劑量槐杞黃清膏（Huai Qi Huang，HQH）藥物治療組。UUO術(shù)后第3天開(kāi)始，分別給予各治

2、療組大鼠槐杞黃清膏1.5、2.25、3.0 g/kg/d生理鹽水混懸劑灌胃。于術(shù)后第7、14天分別處死各組中5只大鼠，獲取腎臟組織。梗阻側(cè)腎臟組織行HE、Masson染色，在光鏡下觀察腎間質(zhì)病理改變并進(jìn)行腎間質(zhì)損傷評(píng)分及纖維化程度評(píng)價(jià)。采用免疫組化方法檢測(cè)腎間質(zhì)α-SMA表達(dá)情況，顯示肌成纖維細(xì)胞堆積程度；Western Blot方法檢測(cè)梗阻側(cè)腎組織α-SMA和TGFβ1蛋白表達(dá)水平。采用實(shí)時(shí)熒光PCR方法定量檢測(cè)CTGF mRNA、F

3、N mRNA基因表達(dá)。
　　結(jié)果：HE及Masson染色法顯示，UUO大鼠術(shù)后7天梗阻側(cè)腎臟間質(zhì)可見(jiàn)明顯纖維化病變；第14天，腎間質(zhì)嚴(yán)重?fù)p傷并伴明顯纖維化病變。免疫組化顯示，腎間質(zhì)纖維化區(qū)域伴有大量α-SMA+細(xì)胞廣泛堆積，并隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增多；中、高劑量槐杞黃清膏治療UUO大鼠后，腎間質(zhì)區(qū)纖維沉積及α-SMA+細(xì)胞數(shù)量在7、14天時(shí)均明顯減少。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示中、高劑量槐杞黃清膏可下調(diào)α-SMA蛋白。CTGF及FN m

4、RNA水平在UUO大鼠梗阻側(cè)腎臟中顯著上調(diào)，而槐杞黃可明顯抑制其表達(dá)。
　　結(jié)論：槐杞黃清膏可抑制腎間質(zhì)纖維化，具有減少腎間質(zhì)肌成纖維細(xì)胞聚集的作用。
　　第二部分槐杞黃對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　目的：探討槐杞黃對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。
　　方法：建立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）腎間質(zhì)纖維化模型。將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組，

5、每組10只，分別為假手術(shù)組，UUO模型組，低、中、高劑量槐杞黃清膏（Huai Qi Huang，HQH）藥物治療組。UUO術(shù)后第3天開(kāi)始，分別給予各治療組大鼠槐杞黃清膏1.5、2.25、3.0 g/kg/d生理鹽水混懸劑灌胃。于術(shù)后第7、14天分別處死各組中5只大鼠，獲取腎臟組織。采用免疫組化及蛋白印跡法檢測(cè)各組大鼠梗阻腎 E-cadherin蛋白表達(dá)情況。培養(yǎng) NRK-52E細(xì)胞，設(shè)立正常對(duì)照組、10ng/ml TGFβ1刺激模型組、

6、TGFβ1+60 ug/ml槐杞黃治療組、TGFβ1+120 ug/m槐杞黃治療組、TGFβ1+180 ug/m槐杞黃治療組。藥物干預(yù)前血清饑餓處理細(xì)胞12h，分別于干預(yù)后6h，12h，24，48h檢測(cè)各組腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin及α-SMA蛋白表達(dá)水平。采用免疫熒光檢測(cè)干預(yù)后24h各組腎小管上皮細(xì)胞 E-cadherin及α-SMA表達(dá)。
　　結(jié)果：假手術(shù)組大鼠腎小管上皮細(xì)胞E-cadherin蛋白高表達(dá)。UUO大鼠E

7、-cadherin蛋白隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而表達(dá)下降。TGFβ110 ng/ml刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E后，隨刺激時(shí)間延長(zhǎng)，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而α-SMA蛋白表達(dá)上調(diào)。在體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，槐杞黃可維持UUO大鼠梗阻腎組織中E-cadherin蛋白的表達(dá)水平。體外實(shí)驗(yàn)證明，槐杞黃可部分抑制由TGFβ1介導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞表型改變，維持其上皮細(xì)胞形態(tài)?；辫近S以劑量和時(shí)間依賴方式有效下調(diào)由 TGFβ1誘導(dǎo)的α-SMA蛋白，并維

8、持E-cadherin蛋白水平。
　　結(jié)論：槐杞黃以劑量依賴方式維持大鼠腎小管細(xì)胞表型，并可直接抑制NRK-52E細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
　　第三部分槐杞黃對(duì)腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化作用的分子機(jī)制
　　目的：探討槐杞黃對(duì)腎小管上皮細(xì)胞信號(hào)通路中miR-200a/ZEBs信號(hào)軸的影響
　　方法：建立大鼠單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）腎間質(zhì)纖維化模型。將50只Wi

9、star大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，分別為假手術(shù)組，UUO模型組，低、中、高劑量槐杞黃清膏（Huai Qi Huang，HQH）藥物治療組。UUO術(shù)后第3天開(kāi)始，分別給予各治療組大鼠槐杞黃清膏1.5、2.25、3.0 g/kg/d生理鹽水混懸劑灌胃。于術(shù)后第7、14天分別處死各組中5只大鼠，獲取腎臟組織。采用實(shí)時(shí)定量PCR方法檢測(cè)各組大鼠梗阻側(cè)腎組織中miR-200a，ZEB1（Zinc finger E-box-binding pr

10、otein-1，ZEB1）和ZEB2 mRNA表達(dá)水平，分析比較各組各個(gè)指標(biāo)的表達(dá)量。TGFβ110 ng/ml刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E3小時(shí)后，檢測(cè)miR-200a，ZEB1和ZEB2 mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠腎臟組織高表達(dá)miR-200a，而ZEB1及ZEB2 mRNA幾乎不表達(dá)。UUO大鼠miR-200a表達(dá)減少，ZEB1及ZEB2 mRNA表達(dá)升高。隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)，mi

11、R-200a逐漸減少，ZEB1及ZEB2 mRNA表達(dá)逐漸增加。槐杞黃各劑量組與模型組相比，miR-200a水平升高（p<0.05），ZEB1及ZEB2 mRNA水平顯著降低（p<0.05）。TGFβ1刺激NRK-52E細(xì)胞后3小時(shí)，miR-200a表達(dá)下調(diào)（p<0.05），而ZEB1及ZEB2 mRNA表達(dá)上調(diào)（p<0.05）?；辫近S共培養(yǎng)可維持miR200a水平（p<0.05），下調(diào)ZEB1及ZEB2 mRNA水平（p<0.05），