槐杞黃抗腎間質(zhì)纖維化的治療作用及其機制研究.pdf

1、第一部分槐杞黃抗UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的療效觀察
　　目的：觀察槐杞黃清膏對UUO模型大鼠腎間質(zhì)病理損傷的影響。
　　方法：建立大鼠單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）腎間質(zhì)纖維化模型。將50只Wistar大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為假手術組，UUO模型組，低、中、高劑量槐杞黃清膏（Huai Qi Huang，HQH）藥物治療組。UUO術后第3天開始，分別給予各治

2、療組大鼠槐杞黃清膏1.5、2.25、3.0 g/kg/d生理鹽水混懸劑灌胃。于術后第7、14天分別處死各組中5只大鼠，獲取腎臟組織。梗阻側腎臟組織行HE、Masson染色，在光鏡下觀察腎間質(zhì)病理改變并進行腎間質(zhì)損傷評分及纖維化程度評價。采用免疫組化方法檢測腎間質(zhì)α-SMA表達情況，顯示肌成纖維細胞堆積程度；Western Blot方法檢測梗阻側腎組織α-SMA和TGFβ1蛋白表達水平。采用實時熒光PCR方法定量檢測CTGF mRNA、F

3、N mRNA基因表達。
　　結果：HE及Masson染色法顯示，UUO大鼠術后7天梗阻側腎臟間質(zhì)可見明顯纖維化病變；第14天，腎間質(zhì)嚴重損傷并伴明顯纖維化病變。免疫組化顯示，腎間質(zhì)纖維化區(qū)域伴有大量α-SMA+細胞廣泛堆積，并隨梗阻時間延長而逐漸增多；中、高劑量槐杞黃清膏治療UUO大鼠后，腎間質(zhì)區(qū)纖維沉積及α-SMA+細胞數(shù)量在7、14天時均明顯減少。蛋白免疫印跡結果顯示中、高劑量槐杞黃清膏可下調(diào)α-SMA蛋白。CTGF及FN m

4、RNA水平在UUO大鼠梗阻側腎臟中顯著上調(diào)，而槐杞黃可明顯抑制其表達。
　　結論：槐杞黃清膏可抑制腎間質(zhì)纖維化，具有減少腎間質(zhì)肌成纖維細胞聚集的作用。
　　第二部分槐杞黃對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響
　　目的：探討槐杞黃對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化的影響。
　　方法：建立大鼠單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）腎間質(zhì)纖維化模型。將50只Wistar大鼠隨機分為5組，

5、每組10只，分別為假手術組，UUO模型組，低、中、高劑量槐杞黃清膏（Huai Qi Huang，HQH）藥物治療組。UUO術后第3天開始，分別給予各治療組大鼠槐杞黃清膏1.5、2.25、3.0 g/kg/d生理鹽水混懸劑灌胃。于術后第7、14天分別處死各組中5只大鼠，獲取腎臟組織。采用免疫組化及蛋白印跡法檢測各組大鼠梗阻腎 E-cadherin蛋白表達情況。培養(yǎng) NRK-52E細胞，設立正常對照組、10ng/ml TGFβ1刺激模型組、

6、TGFβ1+60 ug/ml槐杞黃治療組、TGFβ1+120 ug/m槐杞黃治療組、TGFβ1+180 ug/m槐杞黃治療組。藥物干預前血清饑餓處理細胞12h，分別于干預后6h，12h，24，48h檢測各組腎小管上皮細胞E-cadherin及α-SMA蛋白表達水平。采用免疫熒光檢測干預后24h各組腎小管上皮細胞 E-cadherin及α-SMA表達。
　　結果：假手術組大鼠腎小管上皮細胞E-cadherin蛋白高表達。UUO大鼠E

7、-cadherin蛋白隨梗阻時間延長而表達下降。TGFβ110 ng/ml刺激大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E后，隨刺激時間延長，E-cadherin表達下調(diào)，而α-SMA蛋白表達上調(diào)。在體實驗證實，槐杞黃可維持UUO大鼠梗阻腎組織中E-cadherin蛋白的表達水平。體外實驗證明，槐杞黃可部分抑制由TGFβ1介導的NRK-52E細胞表型改變，維持其上皮細胞形態(tài)?；辫近S以劑量和時間依賴方式有效下調(diào)由 TGFβ1誘導的α-SMA蛋白，并維

8、持E-cadherin蛋白水平。
　　結論：槐杞黃以劑量依賴方式維持大鼠腎小管細胞表型，并可直接抑制NRK-52E細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化。
　　第三部分槐杞黃對腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化作用的分子機制
　　目的：探討槐杞黃對腎小管上皮細胞信號通路中miR-200a/ZEBs信號軸的影響
　　方法：建立大鼠單側輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction, UUO）腎間質(zhì)纖維化模型。將50只Wi

9、star大鼠隨機分為5組，每組10只，分別為假手術組，UUO模型組，低、中、高劑量槐杞黃清膏（Huai Qi Huang，HQH）藥物治療組。UUO術后第3天開始，分別給予各治療組大鼠槐杞黃清膏1.5、2.25、3.0 g/kg/d生理鹽水混懸劑灌胃。于術后第7、14天分別處死各組中5只大鼠，獲取腎臟組織。采用實時定量PCR方法檢測各組大鼠梗阻側腎組織中miR-200a，ZEB1（Zinc finger E-box-binding pr

10、otein-1，ZEB1）和ZEB2 mRNA表達水平，分析比較各組各個指標的表達量。TGFβ110 ng/ml刺激大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E3小時后，檢測miR-200a，ZEB1和ZEB2 mRNA表達水平。
　　結果：實時定量PCR結果顯示，假手術組大鼠腎臟組織高表達miR-200a，而ZEB1及ZEB2 mRNA幾乎不表達。UUO大鼠miR-200a表達減少，ZEB1及ZEB2 mRNA表達升高。隨梗阻時間延長，mi

11、R-200a逐漸減少，ZEB1及ZEB2 mRNA表達逐漸增加?；辫近S各劑量組與模型組相比，miR-200a水平升高（p<0.05），ZEB1及ZEB2 mRNA水平顯著降低（p<0.05）。TGFβ1刺激NRK-52E細胞后3小時，miR-200a表達下調(diào)（p<0.05），而ZEB1及ZEB2 mRNA表達上調(diào)（p<0.05）?；辫近S共培養(yǎng)可維持miR200a水平（p<0.05），下調(diào)ZEB1及ZEB2 mRNA水平（p<0.05），