產EPA-DHA北極細菌的篩選及其聚酮合酶途徑的研究.pdf

1、ω-3超長鏈多不飽和脂肪酸（VLC-PUFAs），特別是二十碳五烯酸（EPA）及二十二碳六烯酸（DHA）對人體健康具有重要的生理作用。魚油是這些??-3 VLC-PUFAs的主要商業(yè)來源，然而由于污染加重及產量有限，已經(jīng)無法滿足不斷增長的市場需求，微藻和海洋細菌已成為?-3 VLC-PUFAs的重要替代來源。目前通過隱甲藻和裂殖壺菌合成DHA的產品已經(jīng)進入市場，但尚無EPA商業(yè)化產品，且針對海洋細菌來源的ω-3 VLC-PUFAs的研究

2、相對較少。本研究擬以北極環(huán)境中分離到的海洋細菌為研究對象，大規(guī)模篩選高效合成 EPA的菌株，同時重點揭示一株海洋細菌通過獨特的聚酮酶合成途徑（PKS）合成DHA的機制。
　　首先，以采自北極地區(qū)的176株細菌為材料，結合 TTC（2,3,5-氯化三苯基四氮唑）顯色反應和氣相色譜（GC）初步篩選產 EPA的菌株，再通過氣質聯(lián)用（GC-MS）確定終產物結構。結果顯示4株菌能夠合成EPA，經(jīng)16S rDNA鑒定，依次為 Nocardio

3、ides plantarum、Compostimonas suwonensis、Flavobacterium omnivorum和Shewanella baltica，其中Nocardioides和Compostimonas種屬尚未有報道產EPA的菌株。此外，編號6-42（Shewanella baltica）的菌株合成的EPA占總脂肪酸百分比含量最高，達到4.9％。因此，我們進一步研究了溫度和淺藍菌素等培養(yǎng)條件對S.baltica6-

4、42菌株EPA含量的影響。在0℃條件下培養(yǎng)，S.baltica6-42菌株的EPA含量達8.8%，相比10℃條件下培養(yǎng)，EPA含量提高了1.5倍；10℃下加入3μg/mL的淺藍菌素后，其EPA含量達7.6%，是未加淺藍菌素時的1.6倍；最終，在0℃下加入3μg/mL的淺藍菌素靜置培養(yǎng)，其EPA含量為11.5%，相比初始的4.9%增加了2.4倍。全基因組測序結果顯示，S.baltica6-42基因組大小為5.1 Mb、GC含量為41.67

5、%，共有4597個編碼基因，占基因組大小的84.35%。將編碼基因的氨基酸序列與COG、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫進行比對，發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與各大代謝通路。我們重點關注參與 EPA合成的PKS途徑中五個基因，整個基因簇大小為18954bp。遺傳進化分析發(fā)現(xiàn)S.baltica6-42的pfa基因簇中PfaABCD蛋白序列保守性較高，而PfaE與其他Shewanella的對應蛋白序列差異明顯。此外，將S.baltica6-42與同種屬的S.b

6、altica OS155和S.baltica OS678進行基因組共線性分析，發(fā)現(xiàn)S.baltica6-42與兩個同種屬的菌株在進化過程中基因組結構發(fā)生了明顯的變化。
　　其次，對一株北極來源的Colwellia psychrerythraea34H合成DHA的機制進行了研究。通過基因組比對，發(fā)現(xiàn)C.psychrerythraea34H中存在編碼DHA合成的關鍵基因簇（pfaEABCD），全長約為20 Kb。經(jīng)高保真長片段PCR擴

7、增獲得pfaE和pfaABCD片段后構建重組質粒，分別命名為pSTV28::pfaE(DHA)和pDHAΔpfaE。含pSTV28::pfaE(DHA)和pDHAΔpfaE雙質粒的DH5?可合成DHA，15℃下培養(yǎng)含量達3.4%，而僅含pDHAΔpfaE質粒的重組菌株不產DHA。隨后構建來源于產DHA、EPA、ARA（二十碳四烯酸）菌株的pfaE重組質粒，依次標記為pfaE（DHA-M）、pfaE（EPA）和pfaE（ARA）。將不同來

8、源的pfaE與C.psychrerythraea34H的pfaABCD共表達，均可合成DHA且pfaE（EPA）組合的重組菌株DHA含量最高，15℃下DHA含量達3.7%。進一步研究了溫度和淺藍菌素對重組菌株合成 DHA的影響，結果表明低溫有利于 DHA的積累，10℃時pfaE（EPA）重組菌株DHA含量最高，達到4.1%，是20℃時DHA產量的13.7倍。加入一定濃度淺藍菌素可促進重組菌株合成DHA。當加入2μg/mL的淺藍菌素到培養(yǎng)