產幾丁質酶細菌的鑒定及產酶和酶學性質的研究.pdf

1、農業(yè)和林業(yè)上遇到的病害幾乎都是由昆蟲和真菌引起的，仔細研究不難發(fā)現(xiàn)，這兩大類的一個非常重要的共同點，那就是其外屏蔽都是由幾丁質組成的。所以，在發(fā)現(xiàn)了化學農藥對環(huán)境和人類造成的不可彌補的重大災害后，人們把注意力朝向了生物防治，因而幾丁質的分解主力—幾丁質酶就無疑地成了人們的研究重點。幾丁質酶的來源多種多樣，有植物幾丁質酶，動物幾丁質酶和微生物幾丁質酶，這其中由于微生物的各種特性，如體積小，面積大，吸收多，轉化快，生長旺，繁殖快，適應強，易

2、變異，分布廣，種類多，基因提取和轉化的方便快捷等等，使其成為多數(shù)學者找尋幾丁質酶的對象。因此，不斷地去尋找篩選產幾丁質酶的微生物，并純化其所產幾丁質酶，研究其性質、作用方式及其作用效果，是目前生物防治研究中的一個新的熱點。 以典型昆蟲(家蠶)為實驗材料，從自然死亡個體的病患部位，即中腸圍食膜出發(fā)，分離篩選產幾丁質酶菌株。為了能使篩選幾率最大限度的提高，本試驗所用的篩選培養(yǎng)基中僅以膠體幾丁質作為唯一碳原，使只能利用膠體幾丁質的菌株

3、才能在該平板上生長。在無菌條件下，用接種環(huán)將死亡個體中腸圍食膜病患部位組織搗碎，挑出，然后在幾丁質平板上劃線，放置28℃培養(yǎng)，72 h后，平板中長出各種不同的能利用膠體幾丁質的菌株，挑取水解圈/菌落直徑之比最大的菌落，得到一株產幾丁質酶細菌，命名為zl1-r。于同樣的膠體幾丁質培養(yǎng)基平板上連續(xù)五代劃線，所得到的水解圈/菌落直徑比值變化不大，這說明該菌株具有穩(wěn)定的產酶傳代能力。本實驗室對該菌株的保藏采用的是甘油速凍保存法和石蠟斜面保存法。

4、 為確定該菌株在生物防治中的作用，將zl1-f菌株接種于膠體幾丁質培養(yǎng)基中純培養(yǎng)72h后，將發(fā)酵液稀釋1/2后分別以涂布法和噴灑法喂食家蠶、菜青蟲及草原蝗蟲，測定其生物防治效果，結果表明該菌株對家蠶、菜青蟲及稻蝗的致死率分別為50％、73.33％和60％。在證實了zl1-r菌株有生物防治效果后，對其進行了菌種鑒定。結合傳統(tǒng)的表型分類、化學分類和現(xiàn)代的分子分類等細菌分類方法，對菌株zl1-r進行了形態(tài)特征、培養(yǎng)特征、生理生化及16

5、S rDNA序列分析。分子生物學鑒定的過程如下：細菌基因組的提取與純化；設計16S rDNA引物，通過PCR技術得到16S rDNA片斷；連接過夜，轉化大腸桿菌感受態(tài)，涂布Amp平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落，提取質粒，酶切檢驗等過程，將16S rDNA進行測序分析。將得出的基因序列在Genebank登錄，根據(jù)測序結果，用RibosomalDatabase Project(RDP Ⅱ)核酸數(shù)據(jù)庫進行序列比對，從RDP Ⅱ數(shù)據(jù)庫中選擇

6、15個同源性最高的模式菌株與zl1-r進行進化樹分析。通過形態(tài)學觀察，生理生化測定及分子生物學鑒定，初步將zl1-r菌株歸為氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)。 為了能更好地了解并改善該菌株產幾丁質酶的條件，本試驗對該菌株的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化分別是從發(fā)酵時間，發(fā)酵溫度，發(fā)酵起始pH值，培養(yǎng)基裝量，碳原，氮原等方面進行的。經過初步研究，發(fā)現(xiàn)該菌株的最佳誘導物為粉狀幾丁質，其次為膠體幾丁質，而片狀幾丁質幾乎不被其利用。

7、通過各種條件下單因素的變化和均勻設計法對該菌株的產酶條件進行優(yōu)化，得出該菌株產酶的最適環(huán)境是：粉狀幾丁質1.2％(w/w)，氮源蛋白胨0.12％(w/w)和K<,2>HPO<,4>0.02％(w/w)，發(fā)酵72 h，溫度為30℃，起始pH為8.0，培養(yǎng)基裝量為15％。本試驗還對該菌株所產生的粗酶液的性質進行了初步研究，結果表明該菌株所產的幾丁質酶的最佳作用溫度為25℃，最佳的作用pH值是5.5，耐溫性較差，在45℃以上就喪失50％以上的