產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母的篩選、鑒定及其酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、目的：廣泛篩選、鑒定產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母，對其產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶進行分離、純化及性質(zhì)研究，為進一步研究其在果蔬采后真菌病害防治中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 方法：利用幾丁質(zhì)作唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，從土壤、水果果實表面以及實驗室保存的菌種中篩選產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母；通過透明圈法和DNS比色法，篩選出酶產(chǎn)量較高的菌株進行鑒定及酶純化研究；觀察該酵母菌株個體和群體培養(yǎng)特征，利用常規(guī)方法進行部分生理生化特征鑒定，并以26SrDNA序列為基礎(chǔ)分析該菌株與其

2、他模式菌株的相似性及同源關(guān)系，綜合這幾項特征對該酵母菌進行鑒定；利用硫酸銨鹽析、DEAE-纖維素(DE32)柱層析、SephadexG-100柱層析對該酵母產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶進行純化，結(jié)果用SDS-PAGE驗證；利用常規(guī)實驗方法研究該酶的基本性質(zhì)，并研究其在平板實驗上對供試病原菌的拮抗活性。 結(jié)果：1.利用幾丁質(zhì)作唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，分離出9株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母菌(依次編號為CY-1～CY-9)，發(fā)現(xiàn)CY-6菌株產(chǎn)酶能力最強，其發(fā)

3、酵液酶活力達2.41U/mL。 2.通過觀察CY-6菌株個體和群體培養(yǎng)特征，進行部分生理生化特征鑒定，發(fā)現(xiàn)該菌株的表型特征與陸生伊薩酵母(Issatchenkiaterricola)最為接近。以26SrDNA的D1/D2區(qū)域為基礎(chǔ)，分析該酵母菌與其他模式菌株序列的相似性并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)該菌株與陸生伊薩酵母(I.terricola)相似性大于99％，且在系統(tǒng)發(fā)育樹中聚成一亞分支。綜合其形態(tài)培養(yǎng)特征、生理生化特征及26SrDN

4、A序列分析結(jié)果，將該酵母鑒定為陸生伊薩酵母(I.terricola)。 3.以不同的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)該酵母產(chǎn)酶，結(jié)果表明膠體幾丁質(zhì)的誘導(dǎo)效果最好。通過純化得到一條分子量約為42.4kD的酶帶，其反應(yīng)的最適溫度和最適pH分別為50℃和7.0，以膠體幾丁質(zhì)為底物的Km和Vmax分別為6.91mg/mL和12.95umol/min。 4.抗菌實驗顯示，用純化后的酶液對供試病原菌進行平板拮抗實驗，發(fā)現(xiàn)該酶對病原菌菌絲的延伸有不同程度的

5、抑制作用。 結(jié)論：1.分離篩選出9株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶酵母菌，其中CY-6菌株產(chǎn)酶能力最強，其發(fā)酵液酶活力達到2.41U/mL。 2.綜合CY-6菌株形態(tài)培養(yǎng)特征和生理生化特征，結(jié)合26SrDNA序列分析結(jié)果，將該酵母鑒定為陸生伊薩酵母(I.terricola)。 3.純化出該酵母菌產(chǎn)生的一種胞外幾丁質(zhì)酶，測得該酶的分子量為42.4kD，酶反應(yīng)的最適溫度和最適pH分別為50℃和7.0，以膠體幾丁質(zhì)為底物的Km和Vmax分